Главная / Статьи / Проблема контроля и стандартизации аллерговакцин

Проблема контроля и стандартизации аллерговакцин


Федосеева В. Н., Камышева В. А., Кравченко С. А., Некрасов А. В., Пучкова Н. Г., Медведев С. А. (ФГБУ «ГНЦ Институт иммунологии» ФМБА РФ)
Радунская С. Ф., Невская Л. В., Лавренчик Е. И. (ГИСК им. Л. А. Тарасевича, Москва)

Проблема стандартизации сложных препаратов, созданных на основе аллергенов (аллерговакцины, аллерготропины и др.) является чрезвычайно актуальной. «Аллерготропины» созданы в ГНЦ — Институте иммунологии ФМБА РФ на основе комплекса аллергоидов пыльцы тимофеевки, березы и иммуномодулятора полиоксидония (патент РФ №2073031). Препараты являются чрезвычайно эффективными при лечении поллинозов. Определение подлинности аллерготропинов — один из основных тестов в оценке качества препаратов. Разработана система контроля подлинности пыльцевых аллерготропинов. По нашим данным надежным критерием подлинности пыльцевого компонента в составе аллерготропинов является их специфическая lgG-связывающая активность. Второй составляющий компонент аллерготропина — полиоксидоний определяется на основе эффекта взаимодействия полиоксидония с ионами меди.

В настоящее время при производстве сложных по составу аллерговакцин обязательным является проведение стандартизации и контроля по следующим показателям: подлинность, присутствие главных аллергенов в препарате, биологической, специфической активности. Проблема стандартизации аллергенов является чрезвычайно важной в аллергологии, так как любые нарушения стандартных норм при производстве сложных форм аллерготропинов, аллерговакцин в клиническом выражении может иметь самые тяжелые и непредсказуемые реакции у больных с аллергией. Тем не менее, существующая система стандартизации аллергенов и их сложных модифицированных форм чрезвычайно далека от совершенства и требует самого пристального внимания специалистов-аллергологов. В качестве примера разработки методологии контроля подлинности сложных препаратов, созданных на основе модифицированных аллергенов и иммуномодулятора, могут быть рассмотрены аллерготропины.

Разработка системы контроля подлинности аллерготропинов

Примером сложных препаратов являются аллерготропины (AT), в состав которых входит аллергоид (специфический компонент) и полиоксидоний (иммуномодулятор) (ПО). Это обстоятельство диктует необходимость разработки оригинальных технологий и критериев оценки специфического IgE- и lgG-связывания для AT, которые являются препаратами, аналогов которым не существует в мировой практике (разработаны в ГНЦ — Институте иммунологии ФМБА РФ, патент РФ №2073031).

Как показали предыдущие исследования, комплексные препараты AT являются чрезвычайно эффективными при лечении поллинозов. AT из пыльцы тимофеевки, березы и ПО обладают сниженной аллергенной активностью в сравнении с нативными аллергенами соответствующей пыльцы. Отсутствие риска стимуляции реакций анафилактического типа при введении AT в сенсибилизированный организм свидетельствовало о безопасности AT. Показано, что AT на основе аллергоидов пыльцы тимофеевки и березы отвечают главным критериям качества лечебных форм аллергенов: специфически активны, безопасны и клинически эффективны.

Наличие в составе AT полиоксидония позволило повысить иммуногенные свойства препарата, в частности, их способность стимулировать синтез специфических IgG (блокирующих) — антител (5, 6, 7, 10, 11). Выявленные позитивные свойства AT свидетельствовали о перспективности их применения в аллергологии как препаратов нового поколения. Однако, в связи с тем, что AT являются комплексными препаратами, специального решения требовал вопрос разработки методологии контроля их подлинности с учетом активности каждого из входящих в AT компонентов.

AT не имеют аналогов среди терапевтических форм аллергенов. В связи с этим, существующие методические подходы к оценке качества аллергенов не соответствуют общепринятым критериям анализа специфичности и подлинности для AT. AT требуют разработки специальных методических подходов, учитывающих обе составляющие препаратов: пыльцевой аллергоид и иммуномодулятор — ПО. В соответствии с требованиями ГИСК им. Л. А. Тарасевича, Фармакопейного Комитета, Министерства здравоохранения Российской Федерации, Этического Комитета при МЗ РФ, все препараты должны быть проконтролированы и охарактеризованы по определенным критериям, отражающим их специфические характеристики [2, 11]. Помимо изучения подлинности, специфичности и безопасности AT требуют разработки специальной тест-системы для определения их IgE- и lgG-связывающих свойств.

Цель настоящего исследования — разработка системы контроля подлинности пыльцевых AT. В качестве одного из критериев подлинности в данном проекте был использован эффект специфического lgG-связывания блокирующих антител с AT.

Указанный эффект является наиболее надежным критерием подлинности пыльцевого компонента в составе AT, так как основан на специфических свойствах аллергоида в составе AT, позволяющих в процессе иммунотерапии вызвать стимуляцию синтеза специфических lgG-антител к пыльцевому аллергену. Второй составляющий компонент аллерготропина — ПО, подлинность которого определяется на основе эффекта взаимодействия ПО с ионами меди.

Материалы и методы

Аллергоиды из пыльцы тимофеевки и березы, представляющие собой модифицированные формальдегидом аллергены, получали по методам, разработанным в Институте иммунологии ФМБА РФ [6, 7, 9, 19]. Получение аллергоидов из пыльцы тимофеевки (Phleum pra-tense) и березы (Betula vulgaris) осуществлялось на основе очищенных нативных аллергенов пыльцы тимофеевки и березы с использованием модифицированного метода Marsh и Райкиса [11, 2, 14].

Изучение подлинности аллергоида в составе аллерговакцин «ТИМПОЛ» (тимофеевка) и «БЕРПОЛ» (береза) проводили методом ИФА (в авторской интерпретации). Подлинность ПО в составе аллерговакцины определялась на основе эффекта взаимодействия ПО с ионами меди. Контроль проводили в ГИСК им. Л. А. Тарасевича.

Результаты и обсуждение

Установлено, что белок-полимерные комплексы AT стимулируют повышенную продукцию lgG-антител. Это происходит, с одной стороны, за счет белковой (антигенной) части комплекса, каковой является аллергоид, а с другой стороны — активатора клеток иммунной системы — ПО (сополимер N-окиси 1,4-этиленпиперазина и N-карбоксиэтил — 1,4-этиленпиперазиний бромида), регистрационный номер 96/302/9, патент РФ №2073031 [3,4].

Снижение аллергенных свойств позволяет вводить большие дозы препарата, что значительно сокращает курс аллергенспецифической иммунотерапии (АСИТ) [1, 5, 7, 8, 9, 10, 15, 16, 17, 18, 20]. Пыльцевые AT рекомендуется применять лицам с гиперчувствительностью к пыльце растений, особенно в случаях, когда лечение больных стандартными нативными аллергенами практически невозможно [12, 13]. Присоединение ПО к аллергоиду усиливает иммунный ответ и снижает риск возникновения осложнений при введении конъюгированных с ПО препаратов в сенсибилизированный организм. Один из этапов исследования заключался в разработке теста на подлинность присутствия в AT специфического пыльцевого компонента.

Определение подлинности пыльцевого компонента в аллергоидах (из пыльцы тимофеевки и березы)

Были сформированы две группы образцов сывороток крови больных поллинозом: с высокими уровнями специфических lgG-антител [14] и, параллельно, — группа образцов из сывороток, которые не содержали специфических lgG-антител к указанным видам пыльцевых аллергенов. Эти образцы были использованы в качестве отрицательных контролей.

В связи с отсутствием в мировой практике «ИФА тест-систем» с фиксированными на твердой фазе AT, возникла необходимость разработки собственной тест-системы, создание которой требовало изучения свойств сорбции AT на планшетах различных торговых фирм.

Способность фиксации AT на планшетах была изучена в экспериментах с использованием полимеров разного качества, в том числе зарубежных и отечественных фирм («Грайнер», «Костар», «Лабсистемс» и др). Оптимальная степень фиксации AT была достигнута на планшетах высокой сорбции фирмы «Медбиополимер» (Россия). Именно эти планшеты были использованы для создания тест-системы ИФА при работе с аллерготропинами «ТИМПОЛ» и «БЕРПОЛ».

Разработка позитивных и негативных контролей для постановки ИФА

В процессе эксперимента, при изучении специфического lgG-связывания позитивных образцов сывороток крови соответствующей специфичности с AT, параллельно отмечали отсутствие специфического lgG-связывания этих препаратов с контрольными отрицательными сыворотками крови. Контрольная — позитивная сыворотка должна содержать специфические lgG-антитела к аллергенам одного вида пыльцы: тимофеевки или березы (по интенсивности в ИФА не менее 3 класса связывания). В исследовательской лаборатории был создан банк сывороток крови больных с классом реакции на аллерген тимофеевки и березы 3-4 класса, прошедших курс АСИТ аллергеном тимофеевки и аллергеном березы.

В таблицах 1 и 2 проводятся данные статистической обработки результатов по определению подлинности AT «БЕРПОЛ» и «ТИМПОЛ» (число сывороток в каждой серии — 8). Показатели оптической плотности (ОП) для контрольной — позитивной (положительной) сыворотки различных AT варьировали в пределах 1,5-3,2. Показатели оптической плотности (ОП) для контрольной — негативной (отрицательной) сыворотки варьировали в пределах 0,07-0,11. Показатели оптической плотности (ОП) для контроля конъюгата были: ОП контр.< ОП отрицат. = 0,05-0,099.

Таблица 1. Результаты специфического IgG-связывания при определении белок-полимерного комплекса АТ «БЕРПОЛ»

Аллерготропин По показателям оптической плотности (ОП)
БЕРПОЛ сер. 7 АТ сер. 8 АТ сер. 9 АТ Коммер. аллерген Примечание
контроль конъюгата
Мат. ожидание М 0,094 0,079 0,099 0,1115 показатели ОП соответствуют требованиям НД
Доверит. интервал m 0,0238 0,0219 0, 0171 0,022
Сравнение результатов        
Разность М2 — M1 0,0175 0,032 0,012  
Уровень значимости p > 0,05 > 0,05 > 0,05  
«+» сыворотка
Мат. ожидание М 1,534 1,514 1,529 3,519 показатели ОП соответствуют требованиям НД
Доверит. интервал m 0,096 0,109 0,073 0,071
Сравнение результатов        
Разность М2 — M1 1,984 2,0046 1,989  
Уровень значимости p < 0,001 < 0,001 < 0,001  
«-» сыворотка
Мат. ожидание М 0,1045 0,099 0,099 0,172 показатели ОП соответствуют требованиям НД
Доверит. интервал m 0,017 0,0097 0,0121 0,0337
Сравнение результатов        
Разность М2 — M1 0,067 0,0723 0,0723  
Уровень значимости p < 0,005 < 0,001 < 0,002  

Таблица 2. Результаты специфического IgG-связывания при определении белок-полимерного комплекса АТ «ТИМПОЛ»

Аллерготропин По показателям оптической плотности (ОП)
ТИМПОЛ сер. 7 АТ сер. 8 АТ сер. 9 АТ Коммер. аллерген Примечание
контроль конъюгата
Мат. ожидание М 0,896 0,0536 0,0527 0,0686 показатели ОП соответствуют требованиям НД
Доверит. интервал m 0,0236 0,0026 0,00218 0,039
Сравнение результатов        
Разность М2 — M1 -0,021
0,0175
0,015 0,0158  
Уровень значимости p > 0,05 > 0,01 > 0,001  
«+» сыворотка
Мат. ожидание М 3,169 3,0602 3,098 3,183 показатели ОП соответствуют требованиям НД
Доверит. интервал m 0,0506 0,0652 0,057 0,122
Сравнение результатов        
Разность М2 — M1 0,014 0,123 0,085  
Уровень значимости p > 0,05 > 0,05 > 0,05  
«-» сыворотка
Мат. ожидание М 0,069 0,075 0,0755 0,0993 показатели ОП соответствуют требованиям НД
Доверит. интервал m 0,063 0,0126 0,0076 0,074
Сравнение результатов        
Разность М2 — M1 0,030 0,024 0,0237  
Уровень значимости p < 0,01 < 0,01 < 0,001  

Определение подлинности AT на присутствие в аллерготропинах полиоксидония

Подлинность ПО измерялась по количественному содержанию ПО в AT. Количественное определение содержания ПО основано на эффекте образования окрашенных в голубой цвет метаплполимерных комплексов, которые образуются при взаимодействии ПО с ионами меди. Наличие других компонентов (аплергоида) оказывает незначительное влияние на результат определения.

Препарат (AT) растворяют при перемешивании в растворе натрия хлорида. Затем полученный раствор переносят в пробирку, прибавляют 0,005 М раствор меди, перемешивают и выдерживают 15 мин. Измеряют оптическую плотность раствора на спектрофотометре в максимуме поглощения при длине волны 663 нм, в кювете толщиной слоя 1 см. В качестве контрольной пробы используют раствор, полученный при смешивании раствора натрия хлорида и 0,005 М раствора меди сульфата. Содержание ПО (X) в г на 1 флакон препарата вычисляют по формуле:

где Dоп. проба — оптическая плотность опытной пробы при 663 нм,
Dконтр — оптическая плотность контрольной пробы без ПО, равная 0,05,
Е 1% 1 см — удельный показатель поглощения, равный 4,1,
n — количество флаконов, равное 5, V1 и V2 — объемы разведения, равные соответственно 6,2 и 6 мл.

Примечание. Содержание ПО в 1 флаконе должно быть не менее 0,056 г и не более 0,069 г. Показатели контролей подлинности АТ-препаратов «ТИМПОЛ» и «БЕРПОЛ», полученные в лабораторных условиях, были подтверждены в ГИСК им. Л.А. Тарасевича, а разработанный способ контроля признан соответствующим требованиям нормативной документации (НД).

Таким образом, обоснована целесообразность разработки оригинальных тест-систем и критериев оценки специфического lgG-связывания при определении подлинности пыльцевых компонентов, входящих в состав AT, а также разработки теста на подлинность присутствия в AT одного из компонентов — ПО.

Эксперименты показали, что созданные препараты аплергоидов из пыльцы тимофеевки и березы, входящие в состав AT, а также ПО, соответствуют требованиям ГИСКа по подлинности вышеназванных компонентов. Созданная система определения подлинности AT, использованная при разработке пыльцевых AT «ТИМПОЛ» и «БЕРПОЛ», была представлена в ГИСК им Л. А. Тарасевича. Результаты экспертизы — положительные.

Литература

  1. Адо А. Д. // «Общая аллергология» — М. — 1978 — 464 с.
  2. Государственная Фармакопея СССР — М. — 1998 — XI — 1,2 т.
  3. Петров Р. В., Хаитов Р. М., Некрасов А. В.//В сб.: Вакцины третьего поколения, ВНИИ ММТИ МЗ СССР — М, — 1987 — с.1-37.
  4. Петров Р. В., Хаитов Р. М., Гущин И. С. и др.// Докл. АМН — 1989 — т. 283 — N 6 — с. 1513-1516.
  5. Федосеева В. Н., Некрасов А. В., Ильина Н. И., Хаитов Р. М., Петров Р. В. //5-й Конгресс «Современные проблемы аллергологии, иммунологии и иммуно-фармакологии» — М — Сб. тр. — 2002 — т. 1 — с. 91-112.
  6. Федосеева В. Н.//5-Й Конгресс «Современные проблемы аллергологии, иммунологии и иммунофар-макологии» — Сб. тр. — 2002 — М. — т. 2 — с. 486.
  7. Федосеева В. Н., Камышева В. А., Читаева В. Г. и др.//»Материалы V съезда иммунологов и аллергологов» СНГ — С — П. — 2003 — с.83.
  8. Фрадкин В. А., Рошаль Н. И.//Методические рекомендации. «Проведение диагностики аллергии тестом укола (прик-тест)». — М®-* 1985.
  9. Фрадкин В. А.// «Диагностические и лечебные аллергены» — М. — «Медицина» — 1990 — с. 356.
  10. Хаитов Р. М., Федосеева В. Н., Некрасов А. В. и др.//Иммунология — 1996 — №6 — с.40-42.
  11. Хаитов Р. М., Федосеева В. Н., Некрасов А. В., Камышева В. А. и др.// «Аллергия, астма и клиническая иммунология» — М. — 2003 — т. 7 — №9 — с. 9-14.
  12. Хутуева С. X.// «Бронхиальная астма» — Нальчик — 1988 — с. 127.
  13. Хутуева С. X., Федосеева В. Н.// «Аллергия и экология» — Нальчик — 1990 — с. 70.
  14. Walsh D. J , Matthews J. A, Demmeade, R;//lnt. Arch. Allergy Immunology — 1990 — p. 419-425.
  15. Grammer L. G., Shaughnessy M. A., Bernhard M. I. et al.//J. Allergy Clin Immunol. — 1987 — v. 80 — p.177-183.
  16. Guerra S, Allegra L, Blasi F, Cottini M.// Allergy — 1998 — Sep;53(9) — 863-869.
  17. Lowenstein H, Wihl JA, Bache Billesbolle K, Bowadt H. //Allergy. — 1984 — Aug -39(6) — p. 421-32.
  18. Medrala W., Wolanczyk-Medrala A., Wrzyszcz M. et al.// Int.Rev. Allergol. Clin. Immunol. — 1999 — vol. 5 — No 1.
  19. Petrov R.,Khaitov R.,Fedoseeva V. et al.//XVII World Asthma Congress — St.-P. — Russia — 5-8 july, 2003 — v. 4 — №47 — p. 95.
  20. Verini M, Rossi N, Verrotti A, Pelaccia G, Nico-demo A, Chiarelli F.//Sci Total Environ — 2001 — Apr 10 — 270 (1) — p. 63-9.
 статья из журнала № 1 [37] март 2010
Главная / Статьи / Проблема контроля и стандартизации аллерговакцин
  Научно-практический журнал "Биопрепараты"
Адрес редакции: ФГУН "ГИСК им. Л.А.Тарасевича" Минздравсоцразвития РФ, 119002, Москва, пер. Сивцев Вражек, 41.
Журнал зарегистрирован в Комитете РФ по печати ПИ №ФС77-26255 от 24.11.2006 г.

web@medep.ru


Совместный проект «Центр иммунопрофилактики МЕДЭП» и «Гелла-Принт»