Главная / Статьи / Требования к производству и контролю препаратов на основе моноклональных антител, применяемых для лечения

Требования к производству и контролю препаратов на основе моноклональных антител, применяемых для лечения


Авдеева Ж.И., Алпатова Н.А., Волкова Р.А., Медуницын Н.В., Борисевич И.В.
ФГУН «ГИСК им. Л.А. Тарасевича» Минздравсоцразвития РФ, Москва, info@gisk.ru

Одним из перспективных современных и интенсивно развивающихся направлений иммунотерапии является использование лекарственных средств, созданных на основе генно-инженерных МкАТ. В статье приведены общие сведения о генно-инженерных лекарственных препаратах на основе МкАТ, зарегистрированных в Российской Федерации, используемых для лечения онкологических, аутоиммунных, инфекционных и аллергических заболеваний. Приведены требования к производству, контролю качества активной субстанции и готовой лекарственной формы препаратов МкАТ, а также требования к продукту на этапе разработки и проведения доклинических испытаний препарата.

One of the promising modern and rapidly developing areas of immunotherapy is the use of medicines that are based on genetically engineered monoclonal antibodies. The article provides an overview of genetically engineered medicines based on monoclonal antibodies that are registered in the Russian Federation, used to treat cancer, autoimmune, infectious and allergic diseases. It describes the requirements for production, quality control of active substance and finished dosage form of monoclonal antibodies medicines, as well as product requirements during the development and preclinical trials of the medicines.

Для корреспонденции
Авдеева Ж. И. – заведующая лаборатории иммунологии ФГУН «ГИСК им. Л.А. Тарасевича» Минздравсоцразвития РФ
Адрес: ФГУН «ГИСК им. Л.А. Тарасевича» Минздравсоцразвития РФ. 119002, Москва, пер. Сивцев Вражек, 41, info@gisk.ru
Статья поступила 20.10.2010 г., принята к печати 22.11.10 г.

В настоящее время все более широкое применение в клинической практике находят высокоэффективные лекарственные средства, созданные на основе моноклональных антител (МкАТ). Указанные препараты используются для лечения заболеваний, характеризующихся длительным прогрессирующим течением – заболевания онкологического профиля, аутоиммунной природы, аллергические заболевания, а также в трансплантологии для профилактики и подавления реакции отторжения [1, 6, 15-17].

МкАТ характеризуются постоянством физико-химических свойств и высокой специфичностью. Источником их получения являются клонированные клетки или организм животного. Они могут быть получены из иммортализованных («бессмертных») В-лимфоцитов в перевиваемой культуре клеток, а также с использованием клеточных линий, полученных на основе технологии рекомбинантной ДНК. Различают следующие виды генно-инженерных МкАТ:

химерные АТ, в которых вариабельные домены тяжелых и легких цепей АТ человека замещены соответствующими доменами АТ другого видового происхождения (преимущественно грызунов — мыши, крысы), обладающими требуемой специфичностью;
гуманизированные АТ, в которых только три короткие гипервариабельные последовательности вариабельных доменов каждой цепи АТ (участки, определяющие комплементарное связывание антигена — CDRs) имеют мышиное (или другое) происхождение и встроены в вариабельный домен АТ человека. Гуманизированные АТ содержат минимум гетерологичных последовательностей (рисунок);
рекомбинантные МкАТ человека — АТ, в которых вариабельные домены тяжелой и легкой цепи АТ человека комбинированы с постоянным регионом АТ человека.

Активным компонентом в лекарственных препаратах на основе МкАТ являются генно-инженерные иммуноглобулины или фрагменты иммуноглобулинов, например, F(ab’)2, продуцируемые одним клоном клеток, характеризующиеся определенной специфичностью. Преимущество генно-инженерных МкАТ перед гетерологичными АТ заключается в их сниженной антигенности, большей продолжительности периода полураспада, более высокой специфичности и функциональной активности, за счет большей концентрации специфических АТ [3,14].

Структура моноклональных антител:
А — химерные МкАТ (из abercade.ru); Б — гуманизированные МкАТ (из consilium-medicum.com).

Механизмы действия МкАТ на клетки-мишени включают иммуноопосредованную (антитело- и комплементзависимую) цитотоксичность, стимуляцию фагоцитоза опухолевых клеток, блокаду рецепторов, способность запускать программу апоптоза клеток, а также тормозить рост опухоли путем подавления образования в ней новых сосудов.

В Российской Федерации зарегистрировано более 15 зарубежных лекарственных препаратов на основе МкАТ. Зарегистрированных отечественных лекарственных препаратов МкАТ в настоящее время нет, однако российские ученые проводят исследования по их разработке.

Основные требования к производству препаратов МкАТ аналогичны требованиям к производству других генно-инженерных препаратов [2,7-11,13]. Для получения высокоочищенного продукта в процессе производства МкАТ используются аффинная, ионообменная и гельпроникающая хроматография, а также другие способы очистки. Процесс производства МкАТ должен быть валидирован, что позволяет подтвердить постоянство (стабильность) процесса, включая стадии ферментации, очистки, методы фрагментации, конъюгации, а также полноту удаления или инактивации возможных инфекционных агентов; полноту удаления примесей, связанных с продуктом или процессом производства (белки и ДНК клеток-хозяина, реагенты, используемые при очистке — белок А и др., антибиотики, компоненты среды культивирования клеток и т.п.).

При разработке лекарственных препаратов на основе МкАТ и последующем проведении доклинических испытаний учитываются следующие требования [4,12].

В досье на препарат следует включать сведения об источнике исходных клеток, используемых для получения линии клеток, продуцирующей МкАТ. Исходные клетки — это все клетки, включая партнеров слияния (лимфоциты, миеломные клетки), фидерные клетки (обеспечивающие оптимальные условия роста целевых клеток) и клетки, используемые для экспрессии рекомбинантных МкАТ. Необходимо привести характеристику и указать происхождение родительских клеток, включая информацию о здоровье доноров клеток или указать источник линий клеток — партнеров слияния. Должны быть охарактеризованы антигены, используемые в качестве иммуногенов при получении родительских клеток, указана процедура иммунизации.

Линия клеток, продуцирующая МкАТ, должна иметь описание процедуры иммортализации, трансфекции и клонирования, а также быть охарактеризована по следующим параметрам — фенотип, изоферменты, иммунохимические, цитогенетические маркеры. Необходимо дать характеристику продуцируемых АТ (специфичность, класс, при необходимости — подкласс секретируемого иммуноглобулина). Должна быть определена стабильность продукции АТ с установленными характеристиками, уровнем экспрессии и гликозилирования. Должна быть охарактеризована стабильность генетических и фенотипических характеристик системы хозяин/вектор для продуктов на основе рекомбинантных ДНК.

МкАТ должны быть охарактеризованы по биохимическим и иммунобиологическим свойствам, по специфичности и перекрестной реактивности АТ. При изучении физико-химических свойств очищенные МкАТ должны быть охарактеризованы по следующим показателям: класс, подкласс, точки гликозилирования, целостность молекулы (соотношение тяжелых/легких цепей), молекулярная масса, N- и С-концевые последовательности аминокислот, вторичная и третичная структура, гетерогенность (изоформы), специфичность, содержание общего белка, наличие агрегатов и фрагментов иммуноглобулина.

Для определения указанных характеристик используют стандартные химические, физические, иммунохимические методы, а также пептидное картирование, определение N- и C-концевых аминокислотных последовательностей, масс-спектрометрию, круговой дихроизм, углеводное картирование, хроматографические, электрофоретические и спектрофотометрические методы [5].

При изучении иммунобиологических свойств МкАТ должны быть охарактеризованы по антигенной специфичности, аффинности, способности связывания комплемента, специфической биологической активности, способности модифицировать соответствующие антигены, стимулировать иммунокомпетентные клетки, индуцировать секрецию цитокинов или других медиаторов, а также реактогенности и/или цитотоксичности в отношении тканевых антигенов человека, не являющихся тканями-мишенями для МкАТ.

При оценке специфической биологической активности препарата, определяющей его клиническую эффективность, используют методы, соответствующие предполагаемому механизму действия МкАТ, воспроизводимые in vitro или in vivo.

Оценка безопасности и специфической биологической активности препаратов МкАТ должна проводиться на соответствующих видах животных. Соответствующим видом является тот, для которого исследуемый препарат МкАТ иммунобиологически активен, что обусловлено наличием соответствующих рецепторов или эпитопов. При выборе вида животного, соответствующего указанным требованиям, проводят исследования с использованием различных иммунохимических или функциональных тестов, позволяющих получить сведения о наличии и локализации рецепторов/эпитопов и оценить возможность использования данных животных при оценке безопасности препарата.

Исследования безопасности препарата МкАТ должны проводиться на животных соответствующего вида и/или животных, антигены тканей которых проявляют перекрёстную реактивность с тканями человека. Только в этом случае имеется возможность оценить токсичность, обусловленную связыванием МкАТ с соответствующим эпитопом или нежелательной перекрёстной тканевой реактивностью. Вид животных, клетки и тканевые структуры которого не экспрессируют желаемые эпитопы, может быть использован для оценки токсичности только в том случае, если была выявлена перекрёстная реактивность с тканями человека. Исследования токсичности на несоответствующих видах животных могут привести к неадекватным выводам. Если не существует соответствующего вида, используют трансгенных животных, экспрессирующих человеческий рецептор, или проводят исследования с использованием гомологичных белков соответствующего вида животных.

Спектр методов контроля в процессе производства очищенных МкАТ, как активной субстанции, зависит от постоянства качества и количества примесей, связанных с продуктом или процессом очистки, обеспечиваемого валидацией технологического процесса. Очищенные МкАТ оценивают на микробиологическую чистоту, бактериальные эндотоксины, чистоту, целостность структуры, специфическую биологическую активность, удельную активность с использованием соответствующих методов и препаратов сравнения или стандартных образцов.

Помимо этого, активная субстанция МкАТ должна быть охарактеризована по содержанию белков клеток-хозяина, векторной ДНК и ДНК клеток-хозяина, а также иных посторонних примесей, связанных с процессом производства. В дальнейшем, при накоплении опыта производства и документальном подтверждении постоянства процедуры очистки, данные тесты проводят выборочно, с отдельными партиями очищенных антител.

Готовый лекарственный препарат контролируют по следующим показателям: растворимость, рН, осмоляльность (не менее 240 мОсмоль/кг с учетом разведения, указанного в Инструкции по применению препарата), содержание воды в лиофилизированных препаратах (не более 3%), извлекаемый объем или масса содержимого емкости, подлинность и структурная целостность, общий белок, стерильность, бактериальные эндотоксины или пирогенность, аномальная токсичность, вспомогательные вещества (стабилизаторы, консерванты и др.).

Для оценки подлинности используют методы определения специфической активности, соответствующие механизму биологического действия.

В зависимости от природы МкАТ, их гетерогенности и изоформ, подлинность и структурную целостность определяют различными методами, включая электрофорез в полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия (SDS) в редуцирующих и нередуцирующих условиях, изоэлектрическое фокусирование, хроматографию (ВЭЖХ и др.) в сравнении со стандартным образцом.

Распределение МкАТ по молекулярной массе определяют методами эксклюзионной хроматографии, гельфильтрации или др. Определение чистоты проводят методом электрофореза в полиакриламидном геле с SDS в редуцирующих и нередуцирующих условиях или методом капиллярного электрофореза. Специфические и неспецифические примеси оценивают на стадии получения очищенных МкАТ. Препараты не должны содержать примесь остаточной ДНК более 10 нг на дозу и белков штамма-продуцента более 0,1% от общего белка.

Для модифицированных антител методы контроля зависят от типа модификации.

Таким образом, достижения биотехнологии позволили совершенствовать технологию получения новых биологически активных продуктов и разработать современные высокоэффективные лекарственные препараты на основе генно-инженерных МкАТ, которые нашли применение в медицинской практике. При разработке лекарственных препаратов МкАТ, технологии их производства, методов оценки качества активной субстанции и готового продукта, проведении доклинического изучения необходимо учитывать как общие требования к производству и испытанию генно-инженерных препаратов, так и особенности, касающиеся только препаратов МкАТ.

Литература:

  1. Белозеров А.П. Лекарственные препараты гуманизированных антител // Провизор. — 2007. — Вып. 20.
  2. ГОСТ Р 52219-2004. Правила производства и контроля качества лекарственных средств.
  3. Кетлинский С.А., Симбирцев А.С. Цитокины. — СПб., 2008.
  4. МР 3.3.2.2359-08. Организация производства и контроль качества моноклональных антител. — М., 2009.
  5. МУК 4.1/42.588-96. Методы контроля медицинских иммунобиологических препаратов. — М., 1996.
  6. Насонов Е.Л. Фактор некроза опухоли альфа — новая мишень для противовоспалительной терапии ревматоидного артрита // Рус. мед. жур. — 2000. — № 8 (17). — С.718-722.
  7. ОСТ 42-510-98 (GMP). Правила организации производства и контроля лекарственных средств. — М., 1998.
  8. Правила производства лекарственных средств GMP Европейского сообщества (GMP EC). — M., 1997.
  9. Производство и контроль качества лекарственных продуктов, полученных с использованием технологии рекомбинантной ДНК. Европейская Комиссия. Директива для предприятий. Общая. Лекарственные средства. — М., 1994.
  10. СП 3.3.2.1288-03. Надлежащая практика производства медицинских иммунобиологических препаратов. — М., 2003.
  11. Технический доклад ВОЗ. Серия № 822 (GMP для биологических продуктов, прил. 1). — М., 1992.
  12. Технический доклад ВОЗ. Серия № 822 (Руководство по обеспечению качества моноклональных антител, используемых для человека, прил. 3). — М., 1992.
  13. Технический доклад ВОЗ. Серия № 823 (GMP для лекарственных продуктов). — М., 1992.
  14. Ярилин А.А. Иммунология, — М., 2010.
  15. Breedveld F. Therapeutic monoclonal antibodies // Lancet. — 2000. — Vol. 355. — P. 735-740.
  16. Markham A., Lamb H.M. Infliximab. A review of its use in the management of rheumatoid arthritis // Drug. — 2000. — Vol. 59. — P. 1341-1359.
  17. Vogel C.L., Cobleigh M.A., Tripathy D. et al. Efficacy and safety of trastuzumab as a single agent in first–line treatment of HER–2 overexpressing metastatic breast cancer (HER2+/MBC) // J. Clin. Oncol. — 2002. — № 3. — P. 719–726.
 статья из журнала № 4 [40] Декабрь 2010
Главная / Статьи / Требования к производству и контролю препаратов на основе моноклональных антител, применяемых для лечения
  Научно-практический журнал "Биопрепараты"
Адрес редакции: ФГУН "ГИСК им. Л.А.Тарасевича" Минздравсоцразвития РФ, 119002, Москва, пер. Сивцев Вражек, 41.
Журнал зарегистрирован в Комитете РФ по печати ПИ №ФС77-26255 от 24.11.2006 г.

web@medep.ru


Совместный проект «Центр иммунопрофилактики МЕДЭП» и «Гелла-Принт»