Главная / Статьи / Использование жидкой питательной среды из ферментативного гидролизата белков обезжиренного коровьего молока в технологии вакцины чумной живой сухой

Использование жидкой питательной среды из ферментативного гидролизата белков обезжиренного коровьего молока в технологии вакцины чумной живой сухой


Лещенко А.А., Тетерин В.В., Лазыкин А.Г., Ежов А.В., Хонин А.З., Мохов Д.А., Бирюков В.В., Багин С.В., Логвинов С.В.
Научно-исследовательский центр Федерального бюджетного учреждения «33 Центральный научно-исследовательский испытательный институт министерства обороны Российской Федерации», Киров

В статье представлены данные изучения возможности использования жидкой питательной среды из ферментативного гидролизата белков обезжиренного коровьего молока в технологии вакцины чумной живой сухой. Вакцина чумная живая сухая, полученная с использованием данной среды, соответствует предъявляемым к ней требованиям нормативной документации и на 25% дешевле, чем препарат полученный по регламентной технологии.

According to aminoacid, peptide and mineral composition requirements, the liquid nutrient medium prepared from the digestion proteins’ hydrolyzate of skim cow milk satisfies the requests of the vaccine’s ЕV strain taken from a plague microbe being deep-cultured. The vaccine plague live dry, received with the help of the specified medium, corresponds to the normative regulations and is 25% cheaper than a preparation received at protocol technology.

Для корреспонденции
А.А. Лещенко – ведущий научный сотрудник Научно-исследовательского центра Федерального бюджетного учреждения «33 Центральный научно-исследовательский испытательный институт министерства обороны Российской Федерации»
Адрес: НИЦФБУ «33 Центральный научно-исследовательский испытательный институт министерства обороны Российской Федерации»
610017 г. Киров, Октябрьский проспект, 119
Статья поступила 17.08.2011 г., принята к печати 25.08.2011 г.

В биотехнологии производства иммунобиологических препаратов (ИБП) важнейшим условием получения полноценного конечного продукта является использование высококачественных питательных сред (ПС).

К основным компонентам ПС, обеспечивающим их питательную ценность, относятся белковые гидролизаты, которые традиционно изготавливаются из пищевого (филейная говяжья вырезка) и непищевого (технический казеин, рыбная кормовая мука и т.д.) сырья [1, 2]. При этом доля ПС из непищевого сырья составляет не более 15% от всего ассортимента выпускаемых в мире сред [3].

В этой связи, становятся понятными стремления исследователей, занимающихся конструированием ПС, направленные на поиск непищевого недефицитного белкового сырья, позволяющего изготавливать стандартизованные питательные основы (ПО) и среды.

В настоящее время в качестве основного белоксодержащего сырья в ПС, нашедших применение в технологии вакцины чумной живой сухой используются кислотные гидролизаты казеина [4, 5].

Однако высокая стоимость и ощутимый дефицит казеина на Российском рынке обусловили необходимость разработки технологии ПО и сред, не зависящей от рыночной конъюнктуры.

Следует отметить, что сырьем для производства сухого казеина служит обезжиренное коровье молоко (обрат). Оно является продуктом переработки цельного молока и используется в технологических процессах приготовления пищевых продуктов, а также при подкормке молодняка в животноводческих хозяйствах. Вполне логичным является вопрос возможности замены готового продукта – казеина на полуфабрикат технологии его получения – обрата, с целью применения последнего в качестве сырья для производства белковых гидролизатов. К положительному моменту при решении данного вопроса относится доступность сырья и его не дефицитность [6]. Помимо этого цена гидролизата из обрата молока будет существенно ниже, чем из сухого казеина. Причина заключается в исключении из технологии казеина самой энергозатратной стадии – термического обезвоживания.

Разработанная сотрудниками НИЦ технология ферментативного гидролиза белков обезжиренного коровьего молока (ФГБОКМ) [7] обеспечила получение субстрата, который по аминокислотному, пептидному и минеральному составам не отличается от стандартного кислотного гидролизата из сухого казеина (КГК) и может использоваться для конструирования микробиологических сред.

Цель работы заключалась в оценке возможности использования жидкой ПС, приготовленной из ферментативного гидролизата белков обезжиренного коровьего молока, в технологии вакцины чумной живой сухой.

Материалы и методы:

В работе использовали вакцинный штамм ЕV чумного микроба линии НИИЭГ из коллекции ФГУН ГИСК им. Л.А.Тарасевича Роспотребнадзора (инв. № 52), обладающего типичными культурально – морфологическими, биохимическими и фаголизабельными свойствами.

При получении чистой рабочей культуры выполняли последовательные пересевы штамма на плотные и жидкие ПС, которые приготовили на основе перевара Хоттингера. Для инокуляции ферментера готовили посевной материал в глубинной культуре на аналогичной среде. Микробы выращивали при температуре (27±2) °С в 20-литровых бутылях с 10 л жидкой среды на основе перевара Хоттингера, при аэрации воздухом – 10 л/мин в течение 48 ч.

Культивирование проводили в ферментерах БИОР (Россия) объемом 0,25 м3 с коэффициентом заполнения 0,6. Биореакторы были оснащены магнитными перемешивающими устройствами, фильтрами тонкой очистки воздуха, датчиками температуры, кислотности среды, скорости перемешивания и расхода воздуха на аэрацию.

Таблица 1. Динамика накопления биомассы чумного микроба штамма ЕV, в процессе его выращивания в ферментерах вместимостью 0,25 м3 с различными питательными средами (Х±I95, n=6)

Питательная среда на основе … Концентрация живых микробов, млрд ж. м. кл.xсм -3, на ? час роста
0 3 6 9 12 15 18 21 24 27
ФГБОКМ 0,5±0,2 0,8±0,3 1,3±0,6 2,5±0,5 4,0±1,0 7,4±0,7 10,8±1,2 14,5±1,9 18,2±3,1 20,9±3,6
КГКд 0,4±0,2 0,7±0,3 1,1±0,3 3,2±1,0 5,4±0,5 7,1±0,6 8,9±0,8 14,2±1,9 19,4±2,7 21,4±4,7

Таблица 2. Параметры кинетики роста культур чумного микроба штамма ЕV, выращенных в ферментерах вместимостью 0,25 м3 в различных питательных средах (Х±I95, n=6)

Питательная среда на основе … Максимальная удельная скорость роста, ч-1 Равновесная концентрация, млрд м.кл. x см-3 Максимальная абсолютная скорость роста, млрд м.кл.x см-3 x ч-1 Время достижения фазового остояния 95% ч Продолжительность одной генерации, ч Число генераций Показатель фазового состояния
ФГБОКМ 0,228±0,022 23,5±4,4 1,51±0,2 25,6±3,8 5,0±1,6 5,3±0,8 0,824±0,016
КГКд 0,194±0,010 27,3±2,6 1,32±0,3 29,9±2,4 7,6±1,3 3,6±0,4 0,786±0,015

Таблица 3. Сравнительная оценка физико-химических и иммунобиологических свойств вакцины чумной живой сухой, приготовленной с использованием различных питательных сред

Показатель качества, свойство Требования НД [3] Результаты исследований вакцины, приготовленной с использованием среды из …
ФГБОКМ КГКд
Внешний вид Пористая масса серовато-белого цвета Пористая масса серовато-белого цвета
Растворимость, мин Через 3 мин гомогенная взвесь серовато-белого цвета без посторонних примесей и хлопьев Через 3 мин гомогенная взвесь серовато-белого цвета без посторонних примесей и хлопьев
Посторонняя микрофлора Не допускается Отсутствует
Потеря в массе при высушивании, процент 4,0, не более 3,1 3,3
Термостабильность, сут 4, не менее 5,8 5,5
Общая концентрация микробных клеток, млрд м.кл. x см-3 от 50 до 100 85 80
Концентрация живых микробных клеток, млрд ж.м.кл. x см-3 - 29,3 26,4
Специфическая безвредность Безвредна Безвредна
Иммуногенность, (ЕД50), ж.м.кл., для …: белых мышей 40000, не более 28350 31780
морских свинок 10000, не менее 8258 8980

При глубинном культивировании использовали экспериментальные (на основе ФГБОКМ) и контрольные (на основе КГК) среды, с содержанием аминного азота (0,110 ± 0,010) %, концентрацией водородных ионов (7,0±0,2) ед. рН. Состав среды включал: ПО, калий фосфорно-кислый двузамещенный, калий фосфорно-кислый однозамещенный, магния сульфат, натрия хлорид, дистиллированную воду. В качестве добавки использовали 20%-ный раствор натрия тиосульфата, который вводили в ферментер перед внесением посевного материала [4].

Процесс осуществлялся по следующему режиму: температура (27±2) °С; кислотность среды (7,1 ± 0,3) ед. рН; скорость непрерывного перемешивания – 176 об/мин, аэрация воздухом – 30 – 35 л/мин; продолжительность – 27 ч.

Параметры кинетики роста культуры рассчитывали по концентрации живых микробов, определяемой методом высева стандартных серийных разведений бактериальных суспензий на агаризованные ПС [8].

Вакцину чумную сухую живую оценивали по физикохимическим и иммунобиологическим свойствам. В ходе работы определяли характеристики качества биопрепарата: внешний вид, растворимость, наличие посторонний микрофлоры, потерю в массе при высушивании, термостабильность, общую концентрация микробных клеток, концентрацию живых микробных клеток, специфическую безвредность и иммуногенность [4].

Результаты и обсуждение:

Выращивание чумного микроба штамма ЕV проводили в периодических условиях. В процессе выращивания и по его окончанию из ферментеров отбирали пробы культуральной жидкости, в которых определяли концентрацию живых микробов. Результаты исследований представлены в таблице 1.

Анализ данных таблицы 1, показал, что экспериментальная ПС, приготовленная на основе ФГБОКМ не оказывала негативного воздействия на рост и накопление биомассы чумного микроба штамма ЕV. Отсутствие статистически значимых различий в результатах по накоплению биомассы в ферментерах с использованием экспериментальной и контрольной ПС позволили рассчитать и проанализировать параметры кинетики роста культур на данных средах (таблица 2).

Представленные в таблице 2 результаты свидетельствовали о том, что культуры, полученные в ПС из ФГБОКМ и КГК, имеют отличия по основным параметрам кинетики роста. Так, на ряду с близкими величинами равновесной концентрации, культуры чумного микроба штамма ЕV при выращивании в ПС из ФГБОКМ имели более высокие значения максимальной удельной скорости роста и меньшую продолжительность одной генерации с большим числом генераций за цикл культивирования. Кроме того, экспериментальные культуры согласно характеристике фазового состояния (0,824) были наиболее близки к завершению процесса роста.

Исследования показали возможность использования ПС из ФГБОКМ для глубинного выращивания и накопления биомассы чумного микроба штамма ЕV. Полученные в процессе глубинного культивирования микробные суспензии использовали на дальнейших этапах приготовления конечного продукта – вакцины чумной живой сухой.

Результаты сравнительной оценки физико – химических и иммунобиологических свойств вакцин, наработанных с использованием экспериментальной и контрольной ПС, представлены в таблице 3.

Как следует из таблицы 3, вакцина чумная живая сухая, приготовленная с использованием экспериментальной (на основе ФГБОКМ) и контрольной (на основе КГК) ПС, не имеют различий по всем изученным показателям и соответствуют требованиям нормативного документа, регламентирующего их качество.

Таким образом, результаты работы свидетельствуют о том, что замена в составе питательной среды КГК на ФГБОКМ не ухудшила её качественных характеристик и обеспечила получение кондиционного полуфабриката при глубинном культивировании чумного микроба штамма ЕV. Кроме того, согласно расчётам, использование в технологии вакцины чумной живой более дешевой по сравнению с регламентной среды (на основе ФГБОКМ) обеспечило снижение её себестоимости на 25%.

Литература:

  1. Микробиологические питательные среды: Каталог ФГУП Научно – производственного объединения «Питательные среды». – Махачкала, 2001.
  2. Равилов А.З., Гильмутдинов Р.Я., Хусанов М.Ш. Микробиологические среды. – Казань, Изд. «Фэн», 1999.
  3. Телишевская А.Я. Белковые гидролизаты: получение, состав, применение. – М.: «Россельхозакадемия», 2000.
  4. Промышленный регламент ПР 08461522-07-08 на производство вакцины чумной живой, лиофилизата для приготовления суспензии для инъекций, ингаляций и накожного скарификационного нанесения.
  5. ГОСТ 17626-81. Казеин технический. Введ.: 31.07.1981 г.
  6. Мурашов А.С. Молочная промышленность Приволжского федерального округа // Молочная промышленность. – 2001 № 4. – С. 8.
  7. Некоторые направления стандартизации питательных сред из казеина. Зайцев В.Ф., Маслов С.А., Комоско Г.В., Лещенко А.А., Лазыкин А.Г., Филимонова Г.В.// Сборник научных трудов, посвященный 75-летию НИИ микробиологии МО РФ. Киров – 2003 С. 145.
  8. Кобазев Н.И. Термодинамические факторы в кинетике размножения простых и сложных прототипов // Журн. физ. хим. - 1962 – Т. 36, вып.1. – С. 21 – 31.
 статья из журнала № 3 [43] июль-сентябрь 2011
Главная / Статьи / Использование жидкой питательной среды из ферментативного гидролизата белков обезжиренного коровьего молока в технологии вакцины чумной живой сухой
  Научно-практический журнал "Биопрепараты"
Адрес редакции: ФГУН "ГИСК им. Л.А.Тарасевича" Минздравсоцразвития РФ, 119002, Москва, пер. Сивцев Вражек, 41.
Журнал зарегистрирован в Комитете РФ по печати ПИ №ФС77-26255 от 24.11.2006 г.

web@medep.ru


Совместный проект «Центр иммунопрофилактики МЕДЭП» и «Гелла-Принт»