Архив
Редакция


Обзоры
Статьи
Обмен опытом
Исторический архив
Новости Минздравсоцразвития России
Новости ГИСКа
Новости ВОЗ
Новости науки
Конгрессы, съезды, конференции
Хроника
Интервью
Некролог

Всероссийская научно-практическая
конференция «Вакцинология-2010»

Главная / Всероссийская научно-практическая конференция «Вакцинология-2010» / Биолого-вирусологическое обоснование антипротеазной терапии гриппа

Биолого-вирусологическое обоснование антипротеазной терапии гриппа


Дивоча В.А.
ГП «Украинский НИИ медицины транспорта», г. Одесса, Украина

Целью работы являлось изучение состояния и роли антипротеиназных систем вируса и реципиента в развитии гриппозной инфекции для обоснования получения и использования принципиально новых лечебных препаратов на основе ингибиторов трипсиноподобных протеиназ.

Работа посвящена изучению взаимодействия протеолитической системы клетки – хозяина с вирусом гриппа, который размножается в ней. В работе разрабатывается новое направление борьбы с гриппозной инфекцией, основанное на блокировании вируса в межклеточном пространстве или при сборке его в самой клетке путем использования специфических антипротеиназных иммунных сывороток или ингибитора трипсиноподобной протеиназы.

В работе использовались вирусы гриппа А и В, трипсиноподобные протеиназы и их ингибиторы, куриные эмбрионы, легкие и кровь белых мышей и крыс, природные и синтетические ингибиторы трипсина, кровь человека. Исследования проводились с использованием вирусологических, биохимических, иммунологических, молекулярно-биологических и радиоизотопных методов исследований.

Установлено, что очистка и концентрация вируса гриппа методами центрифугирования не освобождали вирус гриппа от белков с протеиназной активностью. Доочистка вируса гриппа в ступенчатом градиенте сахарозы показала, что в зоне 38 – 43% концентрации сахарозы локализовалось основное количество вируса гриппа и большая часть протеолитической активности. Первоначально ассоциированная с вирусом гриппа протеиназа в градиенте сахарозы разделилась на четыре изоформы, а из нормальных хорионаллантоисных оболочек – на три изоформы, которые в 345 раз были ниже, чем вирусассоциированные. Эллюция и адсорбция вируса гриппа на формалинизированных эритроцитах показали, что протеолитическая активность не связана с V-антигеном, а, по-видимому, связана с РНП.

Метод электрофореза в ПААГе вируса гриппа в невосстанавливающих условиях показал чёткое разделение протеиназы на 7 – 9 фракций, которые владели высокой протеолитической активностью и различным электрическим зарядом. Протеиназа, ассоциированная с вирусом гриппа, является клеточным ферментом, так как иммунные сыворотки к нормальным хорионаллантоисным оболочкам куриного эмбриона нейтрализовали протеиназу в зоне 35 – 45% сахарозы, где локализовался очищенный вирус гриппа, при этом гемагглютинирующая активность сохранялась. При заражении белых мышей вирусом гриппа А происходило нарушение ферментно-ингибирующего баланса. Наиболее глубокие изменения происходили в первые часы после заражения. Снижение протеиназной активности в первые часы после заражения объясняются увеличением ингибирующей протеиназу активности. При заражении куриных эмбрионов вирусом гриппа А в первые часы происходит увеличение как протеиназной, так и ингибирующей активности. В лёгких заражённых мышей и в куриных эмбрионах имеется соответствие между накоплением инфекционного агента и наступающим снижением протеиназной и ингибирующей активности. При заражении мышей вирусом гриппа В профиль протеиназной активности был не так резко выражен в лёгких и имел отличия по сравнению с вирусом гриппа А. Сходство было отмечено только в первые часы после заражения. Вирусиндуцированный клеточный ингибитор в первые часы после заражения играет важную роль в блокировке протеиназы, после его истощения главную роль в развитии патологии берут на себя трипсиноподобные протеиназы, которые начинают расщеплять гемагглютинин и при этом происходит возрастание инфекционного титра. Из лёгких незаражённых мышей выделено шесть изоформ трипсиноподобной протеиназы, из заражённых вирусом гриппа – восемь изоформ, обладающих высокой удельной протеолитической активностью. Изучены их физико-химические свойства. Установили, что ингибиторы трипсина: триэлин, овомукоид, ингибитор из ячменя и Э-АКК не одинаково ингибировали их протеиназную активность. Оптимальная рН изоформ, выделенных из лёгких незаражённых мышей, находились в зоне 7,0 – 8,0, в то время, как для изоформ, выделенных из зараженных лёгких она отклонилась в кислую сторону (рН 4,0-5,0). При определении молекулярной массы изоформы клеточной трипсиноподобной протеиназы были не гомогенны и содержали низкомолекулярные белки, II и IV содержали по два белка, III и VI изоформы характеризовались только одним белком массой 31 тыс. Да, который отмечался в III изоформе. I, II и III изоформы, выделенные из заражённых лёгких, на электрофореграмме не выявлялись, а в IV, V и VI изоформах происходила замена белков. Установлено, что расщепление гемагглютинина вируса гриппа на две субъединицы происходило под воздействием III-й и VI-й изоформы трипсиноподобной протеиназы, а нарастание инфекционной активности происходило под действием III-й изоформы трипсиноподобной протеиназы, выделенных из лёгких здоровых мышей. Изоформы, выделенные из лёгких мышей, зараженных вирусом гриппа А, через 72 ч после заражения не обладали способностью повышать инфекционный титр вируса. Антипротеиназные иммунные сыворотки к изоформам, выделенным из лёгких незаражённых мышей, блокировали активность трипсина и вирус гриппа не размножался в культуре клеток МДСК. In vivo снижение летальности мышей на 60% выявлено только при действии антисывороток к III изоформе. Из лёгких здоровых мышей выделен ингибитор трипсиноподобных протеиназ с молекулярной массой 47 500 Да, который обладал способностью подавлять развитие инфекционной и гемагглютинирующей активности вируса гриппа на куриных эмбрионах и блокировал развитие гриппозной инфекции у белых мышей в общей дозе 0,126 мкг/мышь. Обоснована возможность и разработана методика получения противовирусного препарата из промышленных отходов производства гамма-глобулина.

В результате проведенных исследований предложено:

  1. Способ получения ингибитора трипсиноподобной протеиназы из легких здоровых мышей.
  2. Использование данного ингибитора в качестве противовирусного препарата.
  3. Способ лечения экспериментальной гриппозной инфекции путем введения ингибитора протеиназ или антипротеиназной сыворотки.
  4. Биоматериал для получения данного ингибитора как противовирусного препарата для людей.
  5. Методика определения защитных возможностей организма в эксперименте.
 статья из журнала № 3 [39] ноябрь 2010


Главная / Всероссийская научно-практическая конференция «Вакцинология-2010» / Биолого-вирусологическое обоснование антипротеазной терапии гриппа


Научно-практический журнал "Биопрепараты"
Адрес редакции: ФГУН "ГИСК им. Л.А.Тарасевича" Минздравсоцразвития РФ, 119002, Москва, пер. Сивцев Вражек, 41.
Журнал зарегистрирован в Комитете РФ по печати ПИ №ФС77-26255 от 24.11.2006 г.

web@medep.ru


Совместный проект «Центр иммунопрофилактики МЕДЭП» и «Гелла-Принт»