Исследование возможности индукции рекомбинантными аденовирусными векторами

Автор: | 06.05.2019

Для обеспечения защиты от вируса гриппа А созданы рекомбинантные аденовирусные векторы, несущие гены гемагглютининов вирусов гриппа птиц субтипа H5. На мышах линии BALB/c было показано, что интраназальная иммунизация рекомбинантными аденовирусами индуцирует протективный иммунный ответ, защищающий мышей не только от летальной дозы вируса гриппа H5 другого субтипа, но и от летальной дозы вирусов гриппа подтипа H1 и H2, относящихся к тому же клайду, что и H5. Однако иммунизация не обеспечивает защиту мышей против вируса гриппа подтипа H3, относящегося к другому клайду. Показано что наличие предсуществующего иммунного ответа на аденовирус не существенно влияет на эффективность интраназальной иммунизации.

Грипп — высококонтагиозное заболевание людей, птиц и млекопитающих вирусной этиологии. Для эффективной борьбы с распространением вируса гриппа необходимы безопасные вакцины, обеспечивающие гетеросубтипический иммунный ответ против различных штаммов вируса гриппа А [1, 20]. Одним из новых подходов к вакцинации являются использование генетических вакцин на основе вирусных векторов [11, 16]. Наиболее перспективными представляются генетические вакцины, созданные с использованием аденовируса человека пятого серотипа (Ад5) [6, 7]. Иммунизация рекомбинантным Ад5 является безопасной, так как вирус содержит делетированный геном и неспособен к размножению в нормальных клетках, что подтверждено многочисленными клиническими испытаниями [9,19]. Возможно интраназальное введение аденовирусных векторов и как следствие, индукция иммунного ответа на слизистой дыхательных путей, то есть именно там, где находятся входные ворота гриппозной инфекции. Аденовирусные вектора не требуют применения адъювантов, так как сами являются активаторами врожденного иммунитета [12, 13].

В последние годы появились работы, согласно которым генетические вакцины на основе Ад5, несущих ген гемагглютинина вируса гриппа А, способны индуцировать перекрестный иммунитет как в пределах одного субтипа [10], так и между разными субтипами вируса, включающими один и тот же подтип гемагглютинина [18].

Такой эффект объясняется тем, что при вакцинации аденовирусными векторами, в организм вводится ген гемагглютинина вируса гриппа, эффективно экспрессирующийся в клетке и экспонирующийся на плазматической мембране, что позволяет сохранить его нативную третичную структуру. При этом индуцируется как клеточный, так и гуморальный ответ на консервативные эпитопы гемагглютинина вируса гриппа. В 2008 г. были опубликованы данные, согласно которым вирусы гриппа по наличию высококонсервативных конформационных эпитопов в составе гемагглютинина для антител широкого спектра действия можно разделить на четыре подгруппы, или клайда: Н1 (H1, H2, H5, H6, H11, H13 и H16 гемагглютинины), Н9 (H9, Н8 и Н12), Н7 (Н15, Н7 и Н10) и Н3 клайд (Н3, Н14 и Н4). Антитела против антигенных детерминант вирусов одного клайда в разной степени обеспечивают нейтрализацию этих подтипов, но не обеспечивают нейтрализацию подтипов из другого клайда [17].

Нами было высказано предположение о том, что вакцинация аденовирусным вектором, несущим ген гемагглютинина вируса гриппа А, может приводить к образованию антител к его консервативным эпитопам гемагглютинина, что обеспечит перекрестный иммунный ответ не только против вирусов гриппа А внутри одного подтипа, но и против вирусов гриппа А разных подтипов, относящихся к одному клайду. Поэтому цель данной работы — исследование возможности индукции рекомбинантными аденовирусными векторами гетеросубтипического иммунного ответа против вируса гриппа А.

В работе использовались рекомбинантные аденовирусы человека пятого серотипа, несущие гены гемагглютининов вируса гриппа птиц H5N2 и H5N1. Показано, что иммунизация рекомбинантными аденовирусами обеспечивает индукцию протективного иммунного ответа, защищающего иммунизированных мышей не только от летальной дозы вируса гриппа «своего» штамма H5, но и от летальной дозы вируса гриппа H5 другого субтипа, а так же летальной дозы вирусов, относящихся к тому же клайду, что и H5, но не обеспечивает протекцию мышей против вируса гриппа другого клайда.

Экспериментальная часть

Вирусы. Для инфицирования животных использовали вирусы гриппа птиц A/Mallard duck/Pennsylvania/10218/84 (H5N2), A/black duck/New Jersey/1580/78(H2N3) вирусы гриппа человека A/USSR/90/77 (H1N1) и A/Aichi/2/68 (H3N2), адаптированные для мышей [15], любезно предоставленные проф., д.б.н. Ю.А. Смирновым (лаборатория субвирусных структур ФГБУ «НИИ вирусологии им. Д.М. Ивановского» Минздравсоцразвития РФ).

Определение уровня антител к вирусу гриппа и аденовирусу человека пятого серотипа с помощью реакции вируснейтрализации. Реакцию вирус-нейтрализации (РВН) проводили как описано ранее [4] на линиях клеток A549 (для постановки реакции нейтрализации аденовируса человека пятого серотипа) и MDCK (для постановки реакции нейтрализации вируса гриппа А).

Определение титра IgA и IgG. Использовали метод непрямого ИФА. В качестве антигена использовали сконцентрированный в сахарозе вирус гриппа птиц A/Mallard duck/PA/10218/84 (H5N2). Концентрацию антигена для определения уровня IgG и IgA в исследуемых образцах определяли с помощью «шахматного титрования». Для проведения реакции использовали антитела к мышиным IgA и IgG, конъюгированные с пероксидазой «Sigma» и TMB-индикаторную смесь. Оптическую плотность окрашенного продукта определяли при длине волны 450 нм.

Мыши. В работе использованы мыши линии BALB/c, весом 7–9 г, самки. Все работы выполняли в соответствии с «Правилами проведения работ с использованием экспериментальных животных».

Иммунизация животных. Мыши были разделены на группы (по 10 особей в группе) и иммунизированы двукратно интраназально рекомбинантными аденовирусами Ad-HА5-1 и Ad-HА5-2 в количестве 108 БОЕ/мышь. Интервал между иммунизациями составил 21 день. Контрольных групп было две: первой введен аденовирусный вектор Ad-null; второй — фосфатный буфер PBS. Через три недели после иммунизации мышей опытной и контрольных групп заражали вирусом гриппа или у них отбирали биологические жидкости для определения титра антител к вирусу гриппа.

Заражение животных. Через 21 день после иммунизации мышам под легким эфирным наркозом интраназально вводили высокую летальную дозу (50 ЛД50) вируса гриппа штаммов A/Mallard duck/Pennsylvania/10218/84 (H5N2), или летальные дозы (10 LD50) вирусов гриппа A/USSR/90/77 (H1N1), A/black duck/New Jersey/1580/78(H2N3) и A/Aichi/2/68 (H3N2). Выживаемость и изменение веса мышей оценивали в течение 16 дней после заражения.

Результаты и обсуждение

Нами было показано, что двукратная интраназальная иммунизация лабораторных мышей рекомбинантным аденовирусом Ad5-HA5-2, несущим ген гемагглютинина вируса гриппа H5N2, обеспечивает индукцию высокого уровня специфических антител к вирусу гриппа H5N2 и полную защиту мышей от заражения летальной дозой вируса H5N2 (50 ЛД50) [2, 3].

Для изучения перекрестного иммунного ответа на той же модели летальной инфекции вируса гриппа H5N2, использовали рекомбинантной аденовирус Ad5-HA5-1, несущий ген гемагглютинина вируса гриппа птиц H5N1. Гомология аминокислотной последовательности гемагглютининов этих вирусов гриппа составляет 94,6% (http://align.genome.jp/).

Через три недели после двукратной интраназальной иммунизации аденовирусом Ad5-HA5-1 у животных отбирали кровь для определения уровня перекрестных антител к вирусу гриппа птиц H5N2 методами ИФА, РТГА и РВН. Установлен высокий уровень IgG к вирусу гриппа H5N2, а так же вируснейтрализующих и гемагглютинин-связывающих антител, что свидетельствует об индукции перекрестного гуморального иммунитета, специфичного к вирусу гриппа H5N2 (таблица).