Проблема контроля и стандартизации аллерговакцин

Автор: | 06.05.2019

Проблема стандартизации сложных препаратов, созданных на основе аллергенов (аллерговакцины, аллерготропины и др.) является чрезвычайно актуальной. «Аллерготропины» созданы в ГНЦ — Институте иммунологии ФМБА РФ на основе комплекса аллергоидов пыльцы тимофеевки, березы и иммуномодулятора полиоксидония (патент РФ №2073031). Препараты являются чрезвычайно эффективными при лечении поллинозов. Определение подлинности аллерготропинов — один из основных тестов в оценке качества препаратов. Разработана система контроля подлинности пыльцевых аллерготропинов. По нашим данным надежным критерием подлинности пыльцевого компонента в составе аллерготропинов является их специфическая lgG-связывающая активность. Второй составляющий компонент аллерготропина — полиоксидоний определяется на основе эффекта взаимодействия полиоксидония с ионами меди.

В настоящее время при производстве сложных по составу аллерговакцин обязательным является проведение стандартизации и контроля по следующим показателям: подлинность, присутствие главных аллергенов в препарате, биологической, специфической активности. Проблема стандартизации аллергенов является чрезвычайно важной в аллергологии, так как любые нарушения стандартных норм при производстве сложных форм аллерготропинов, аллерговакцин в клиническом выражении может иметь самые тяжелые и непредсказуемые реакции у больных с аллергией. Тем не менее, существующая система стандартизации аллергенов и их сложных модифицированных форм чрезвычайно далека от совершенства и требует самого пристального внимания специалистов-аллергологов. В качестве примера разработки методологии контроля подлинности сложных препаратов, созданных на основе модифицированных аллергенов и иммуномодулятора, могут быть рассмотрены аллерготропины.

Разработка системы контроля подлинности аллерготропинов

Примером сложных препаратов являются аллерготропины (AT), в состав которых входит аллергоид (специфический компонент) и полиоксидоний (иммуномодулятор) (ПО). Это обстоятельство диктует необходимость разработки оригинальных технологий и критериев оценки специфического IgE- и lgG-связывания для AT, которые являются препаратами, аналогов которым не существует в мировой практике (разработаны в ГНЦ — Институте иммунологии ФМБА РФ, патент РФ №2073031).

Как показали предыдущие исследования, комплексные препараты AT являются чрезвычайно эффективными при лечении поллинозов. AT из пыльцы тимофеевки, березы и ПО обладают сниженной аллергенной активностью в сравнении с нативными аллергенами соответствующей пыльцы. Отсутствие риска стимуляции реакций анафилактического типа при введении AT в сенсибилизированный организм свидетельствовало о безопасности AT. Показано, что AT на основе аллергоидов пыльцы тимофеевки и березы отвечают главным критериям качества лечебных форм аллергенов: специфически активны, безопасны и клинически эффективны.

Наличие в составе AT полиоксидония позволило повысить иммуногенные свойства препарата, в частности, их способность стимулировать синтез специфических IgG (блокирующих) — антител (5, 6, 7, 10, 11). Выявленные позитивные свойства AT свидетельствовали о перспективности их применения в аллергологии как препаратов нового поколения. Однако, в связи с тем, что AT являются комплексными препаратами, специального решения требовал вопрос разработки методологии контроля их подлинности с учетом активности каждого из входящих в AT компонентов.

AT не имеют аналогов среди терапевтических форм аллергенов. В связи с этим, существующие методические подходы к оценке качества аллергенов не соответствуют общепринятым критериям анализа специфичности и подлинности для AT. AT требуют разработки специальных методических подходов, учитывающих обе составляющие препаратов: пыльцевой аллергоид и иммуномодулятор — ПО. В соответствии с требованиями ГИСК им. Л. А. Тарасевича, Фармакопейного Комитета, Министерства здравоохранения Российской Федерации, Этического Комитета при МЗ РФ, все препараты должны быть проконтролированы и охарактеризованы по определенным критериям, отражающим их специфические характеристики [2, 11]. Помимо изучения подлинности, специфичности и безопасности AT требуют разработки специальной тест-системы для определения их IgE- и lgG-связывающих свойств.

Цель настоящего исследования — разработка системы контроля подлинности пыльцевых AT. В качестве одного из критериев подлинности в данном проекте был использован эффект специфического lgG-связывания блокирующих антител с AT.

Указанный эффект является наиболее надежным критерием подлинности пыльцевого компонента в составе AT, так как основан на специфических свойствах аллергоида в составе AT, позволяющих в процессе иммунотерапии вызвать стимуляцию синтеза специфических lgG-антител к пыльцевому аллергену. Второй составляющий компонент аллерготропина — ПО, подлинность которого определяется на основе эффекта взаимодействия ПО с ионами меди.

Материалы и методы

Аллергоиды из пыльцы тимофеевки и березы, представляющие собой модифицированные формальдегидом аллергены, получали по методам, разработанным в Институте иммунологии ФМБА РФ [6, 7, 9, 19]. Получение аллергоидов из пыльцы тимофеевки (Phleum pra-tense) и березы (Betula vulgaris) осуществлялось на основе очищенных нативных аллергенов пыльцы тимофеевки и березы с использованием модифицированного метода Marsh и Райкиса [11, 2, 14].

Изучение подлинности аллергоида в составе аллерговакцин «ТИМПОЛ» (тимофеевка) и «БЕРПОЛ» (береза) проводили методом ИФА (в авторской интерпретации). Подлинность ПО в составе аллерговакцины определялась на основе эффекта взаимодействия ПО с ионами меди. Контроль проводили в ГИСК им. Л. А. Тарасевича.

Результаты и обсуждение

Установлено, что белок-полимерные комплексы AT стимулируют повышенную продукцию lgG-антител. Это происходит, с одной стороны, за счет белковой (антигенной) части комплекса, каковой является аллергоид, а с другой стороны — активатора клеток иммунной системы — ПО (сополимер N-окиси 1,4-этиленпиперазина и N-карбоксиэтил — 1,4-этиленпиперазиний бромида), регистрационный номер 96/302/9, патент РФ №2073031 [3,4].

Снижение аллергенных свойств позволяет вводить большие дозы препарата, что значительно сокращает курс аллергенспецифической иммунотерапии (АСИТ) [1, 5, 7, 8, 9, 10, 15, 16, 17, 18, 20]. Пыльцевые AT рекомендуется применять лицам с гиперчувствительностью к пыльце растений, особенно в случаях, когда лечение больных стандартными нативными аллергенами практически невозможно [12, 13]. Присоединение ПО к аллергоиду усиливает иммунный ответ и снижает риск возникновения осложнений при введении конъюгированных с ПО препаратов в сенсибилизированный организм. Один из этапов исследования заключался в разработке теста на подлинность присутствия в AT специфического пыльцевого компонента.

Определение подлинности пыльцевого компонента в аллергоидах (из пыльцы тимофеевки и березы)

Были сформированы две группы образцов сывороток крови больных поллинозом: с высокими уровнями специфических lgG-антител [14] и, параллельно, — группа образцов из сывороток, которые не содержали специфических lgG-антител к указанным видам пыльцевых аллергенов. Эти образцы были использованы в качестве отрицательных контролей.

В связи с отсутствием в мировой практике «ИФА тест-систем» с фиксированными на твердой фазе AT, возникла необходимость разработки собственной тест-системы, создание которой требовало изучения свойств сорбции AT на планшетах различных торговых фирм.

Способность фиксации AT на планшетах была изучена в экспериментах с использованием полимеров разного качества, в том числе зарубежных и отечественных фирм («Грайнер»«Костар»«Лабсистемс» и др). Оптимальная степень фиксации AT была достигнута на планшетах высокой сорбции фирмы «Медбиополимер» (Россия). Именно эти планшеты были использованы для создания тест-системы ИФА при работе с аллерготропинами «ТИМПОЛ» и «БЕРПОЛ».

Разработка позитивных и негативных контролей для постановки ИФА

В процессе эксперимента, при изучении специфического lgG-связывания позитивных образцов сывороток крови соответствующей специфичности с AT, параллельно отмечали отсутствие специфического lgG-связывания этих препаратов с контрольными отрицательными сыворотками крови. Контрольная — позитивная сыворотка должна содержать специфические lgG-антитела к аллергенам одного вида пыльцы: тимофеевки или березы (по интенсивности в ИФА не менее 3 класса связывания). В исследовательской лаборатории был создан банк сывороток крови больных с классом реакции на аллерген тимофеевки и березы 3-4 класса, прошедших курс АСИТ аллергеном тимофеевки и аллергеном березы.