Главная / Обмен опытом / Методические подходы к определению чувствительности амплификационных наборов реагентов и прогнозированию ожидаемой концентрации возбудителя в биопробах по результатам ПЦР

Методические подходы к определению чувствительности амплификационных наборов реагентов и прогнозированию ожидаемой концентрации возбудителя в биопробах по результатам ПЦР


1Меркулов В.А., 2Борисевич И.В., 1Сизикова Т.Е., 1Мельникова Е.В., 1Меркулова О.В., 1Мельников Д.Г., 1Петров А.А., 1Пирожков А.П., 1Лебедев В.Н., 1Пантюхов В.Б.
1Филиал ФГУ «48 ЦНИИ Министерства обороны Российской Федерации – Вирусологический центр», Московская обл., Сергиев Посад-6
2ФГУН «ГИСК им. Л.А. Тарасевича» Минздравсоцразвития РФ, Москва, info@gisk.ru

В статье обсуждаются методические подходы к определению чувствительности амплификационных наборов реагентов и прогнозированию ожидаемой концентрации возбудителя в биопробах по результатам ПЦР на примере диагностикума, предназначенного для выявления методом обратной транскрипции-полимеразной цепной реакции (ОТ-ПЦР) РНК вируса Хунин, вызывающего Аргентинскую геморрагическую лихорадку. Полученные авторами результаты указывают на возможность прогнозирования ожидаемой концентрации возбудителя в биопробах по результатам ОТ-ПЦР. Предложенные методические подходы являются универсальными для ПЦР-наборов реагентов, предназначенных для выявления геномных нуклеиновых кислот (НК) возбудителей инфекционных болезней.

The article describes methodological approaches to determine sensitivity of amplification reagent kits and to prognosticate expected concentrations of the causative agent in bioassays by the results of PCR by example of the diagnosticum intended to reveal RNA of Junin virus by the method of reverse transcriptase polymerase chain reaction (RT-PCR). The results obtained by the authors show the possibility of prognostication of expected concentration of causative agent in bioassays by the results of RT-PCR. The proposed methodological approaches are universal for the PCR reagent kits designed to identify the genomic nucleic acids (NA) of causative agents of infectious diseases.

Для корреспонденции
Меркулов В.А.
Адрес: Филиал ФГУ «48 ЦНИИ Министерства обороны Российской Федерации – Вирусологический центр». 141306, Московская обл., Сергиев Посад-6.
Статья поступила 20.05.2010 г., принята к печати 22.11.2010 г.

Важнейшей характеристикой наборов реагентов для выявления и идентификации возбудителей инфекционных болезней, является чувствительность [1, 2, 5, 7]. Однако в настоящее время единая методология определения чувствительности ПЦР наборов отсутствует. Целью представленной работы является разработка методических подходов к определению чувствительности амплификационных наборов реагентов и прогнозированию ожидаемой концентрации возбудителя в биопробах по результатам ПЦР.

Для достижения поставленной цели нам было необходимо решить следующие задачи:

  • усовершенствовать определение величины чувствительности разрабатываемых амплификационных наборов реагентов;
  • разработать методические подходы для прогнозирования ожидаемой концентрации возбудителя в биологических пробах по результатам ПЦР.

Под чувствительностью метода в данной работе понимается минимальная концентрация возбудителя в исследуемой пробе, при исследовании которой с помощью данного метода получают положительный результат [7-10].

Материалы и методы

Вирус Хунин – возбудитель Аргентинской геморрагической лихорадки (АГЛ) штамм XJpR37/5787 (НКВ-22), получен из Национальной коллекции вирусов I группы патогенности филиала ФГУ «48 ЦНИИ Минобороны России-ВЦ».

В опытах использован набор реагентов для выявления РНК вируса Хунин методом ОТ-ПЦР, разработанный в филиале ФГУ «48 ЦНИИ Минобороны России-ВЦ», состоящий из 4 комплектов: для выделения РНК, проведения реакции обратной транскрипции, проведения ПЦР и электрофоретической детекции продуктов ПЦР. ОТ-ПЦР-анализ проводили по стандартной методике [8].

Перевиваемые культуры клеток почки африканской зеленой мартышки Vero B и GMK-AH-1(Д) получали из музея отдела клеточных культур ФГУ «48 ЦНИИ Минобороны России-ВЦ». В экспериментах по определению вируса в крови использовали морских свинок весом 250…300 г. Животных получали из питомника ФГУ «48 ЦНИИ Минобороны России-ВЦ». Статистическую обработку данных проводили в соответствие с руководствами [4, 6].

Результаты и обсуждение

Нами разработана методика определения чувствительности метода ОТ-ПЦР для выявления РНК вируса Хунин. В качестве вируссодержащего материала использован свежеприготовленный культуральный препарат вируса Хунин, штамм XJpR37/5787, полученный после выращивания в монослойной перевиваемой культуре клеток почки африканской зеленой мартышки (клон Vero B). Биологическая активность вируссодержащего материала составляла 1,0·106 бляшкообразующих единиц (БОЕ) в 1 мл.

Для анализа проб в ОТ-ПЦР готовили серийные разведения возбудителя. До определенного уровня (соответствующего расчетной концентрации биологически активного вируса, равной 1,0·103 БОЕ·мл-1) использовали десятикратный шаг разведения, далее двукратный шаг. Концентрация биологически активного возбудителя в наибольшем из приготовленных разведений должна быть заведомо ниже ожидаемого порога чувствительности, т.е. в данном разведении возбудитель не мог быть выявлен используемым методом ПЦР.

Приготовленные разведения возбудителя подвергали пробоподготовке (обрабатывали исходный материал для освобождения НК вируса от липопротеиновых оболочек) и затем выявляли наличие в пробах РНК вируса Хунин.

За чувствительность метода принимали расчетную концентрацию возбудителя в наибольшем разведении, в котором установлена положительная реакция при использовании метода ОТ-ПЦР. Положительной реакция считалась при выявлении в электрофорезе фрагмента НК, который соответствует расчетной длине амплификата. Чувствительность метода определяли по формуле:

S = A x Р, (1)

где: S – чувствительность метода, выраженная в БОЕ·мл-1;
А – концентрация биологически активного возбудителя в исследуемом препарате, выраженная в БОЕ·мл-1;
Р – наибольшее разведение исследуемого препарата (безразмерная величина), в котором при проведении ОТ-ПЦР еще установлена положительная реакция. Чем меньше величина S, тем выше чувствительность метода ПЦР.

Для корректного определения чувствительности по концентрации биологически активного возбудителя в данной формуле следует в первую очередь обратить внимание на первый множитель произведения. Дело состоит в том, что при использовании одного и того же вируссодержащего препарата величина А в значительной степени варьирует в зависимости от условий его приготовления и хранения. Например, полученные нами экспериментальные данные свидетельствуют, что если для свежеприготовленного вируссодержащего материала концентрация биологически активного вируса Хунин составляет 1,0·106 БОЕ·мл-1, то для препарата, приготовленного тем же методом и хранившегося один месяц при температуре от 2 до 6°С – примерно 2,0·104 БОЕ·мл-1.

В то же время практика показывает, что величина Р (см. формулу (1)) при определении в ОТ-ПЦР сохраняется на примерно одинаковом уровне. Как следствие этого, чувствительность метода будет максимальной во втором случае, а минимальной – при использовании в экспериментах свежеприготовленного материала. Отсюда следует, что величина чувствительности метода ПЦР зависит от биологической активности вируса в исследуемом препарате.

Возможным вариантом правильного решения задачи по определению чувствительности метода по биологической активности является использование в экспериментах паспортизованных культур возбудителей, взятых в пределах гарантийного срока их хранения. В этом случае мы можем принимать за величину А в формуле (1) – паспортное значение биологической активности, определенное для свежеприготовленной культуры.

Следующим важным моментом является возможная величина ошибки при определении чувствительности метода. Поскольку процесс определения чувствительности включает две операции – определение величин А и Р, то

σs = ✓σa2 + σp2, (2)

где: σs – средняя квадратическая ошибка определения чувствительности;
σa – средняя квадратическая ошибка определения концентрации биологически активного вируса (величины А);
σp – средняя квадратическая ошибка определения величины высшего разведения исследуемого препарата (величины Р), в котором при проведении ОТ-ПЦР еще установлена положительная реакция.

Величина σa зависит от способа определения концентрации биологически активного вируса. В вирусологической практике наиболее широко используется метод негативных колоний. При оценке ошибки метода определения концентрации биологически активного вируса Хунин при титровании на постоянной культуре клеток почки африканской зеленой мартышки, клон GMK-AH-1 (Д), нами экспериментально установлено, что величина σa, определенная в параллельных независимых опытах, составляет 0,35 lg.

Для оценки величины σp необходимо подобрать такой шаг разведения, при котором при достаточно большой выборке пограничные положительные результаты будут зарегистрированы в трех смежных разведениях, и затем сравнить достоверность различий интегральных кривых распределений частот положительных результатов с таковой для соответствующего биномиального распределения.

Для определения величины σp нами были проведены следующие эксперименты. Для одной и той же культуры вируса Хунин в 50-кратной повторности с использованием критерия «единственного различия» было проведено определение величины S при использовании шага разведения 1:2. Полученные результаты представлены в табл. 1.

Поскольку экспериментально полученное интегральное распределение (0,16-0,76-1,00) недостоверно отличается от соответствующего теоретического биномиального распределения (0,25-0,75-1,00), то можно сделать вывод, что при двукратном шаге разведения величина σp приблизительно равна десятичному логарифму шага разведения (0,3 lg). Подставляя полученные значения величин σа и σp в уравнение (2) получаем величину σs, равную 0,45 lg, что соответствует при переходе от логарифмов к натуральным числам значению ошибки определения, равной х/: 2,82.

Таблица 1. Результаты определения величины чувствительности метода при постановке ОТ-ПЦР с набором реагентов для выявления РНК вируса Хунин

А,
(расчетная величина, БОЕ·мл-1)
Р,
разведение
С,
(АxР)
Число случаев определения
данного значения Р = S
S (расчетная величина, БОЕ·мл-1)
Абсолютная величина Доля, процент
1,0·106 2,0·10-3 2,0·103 0 0 -
1,0·10-3 1,0·103 12 24 1,0·103
5,0·10-4 5,0·102 30 60 5,0·102
2,5·10-4 2,5·102 8 16 2,5·102
1,25·10-4 1,25·102 0 0 -

Примечания:
А – концентрация биологически активного вируса в исходной культуре, БОЕ·мл-1;
Р – разведение исходной культуры;
С – концентрация вируса в пробе;
S – чувствительность метода (соответствует концентрации вируса в высшем разведении, в котором еще отмечена положительная реакция), БОЕ·мл-1;
«–» – расчет величины S некорректен.

Таблица 2. Результаты определения вируса Хунин в пробах крови инфицированных морских свинок с помощью метода ОТ-ПЦР и по методу негативных колоний

№ проб Р Биологическая активность, БОЕ·мл-1 Арасч / Афакт АрасчфактХ±σ
расчетная по результатам ОТ-ПЦР фактическая
1 2-2 1,4·103 1,5·103 0,93 1,05±0,24
2 2-1 7,0·102 4,8·102 1,46
3 2-1 7,0·102 7,8·102 0,90
4 2 0 3,5·102 4,0·102 0,87
5 2-1 7,0·102 5,6·102 1,25
6 2 0 3,5·102 4,0·102 0,87

Примечания:

  1. Р – Высшее разведение, в котором была зарегистрирована положительная реакция в ПЦР.
  2. – Различия между Арасч и Афакт статистически недостоверны.
  3. – Коэффициент корреляции между Арасч и Афакт (r =0,95) является значимым с вероятностью более 99%.

Исходя из механизма амплификации ДНК, при проведении ПЦР, можно сделать вывод о том, что расчетная величина чувствительности метода соответствует концентрации, при которой в одной реакционной смеси в среднем будет находиться один ген-эквивалент нуклеиновой кислоты, способный к амплификации. Для подтверждения того факта, что определенная в опыте чувствительность набора реагентов соответствует ее расчетному значению, определяли долю положительных результатов ПЦР в независимо приготовленных пробах с критическим значением величины Р.

Как следует из данных, представленных в табл. 1, наиболее часто определяемая величина чувствительности (5·102 БОЕ·мл-1) дает положительный результат в 76 (60+16)% случаев. В тоже время если в исследуемой пробе будет в среднем содержаться n ген-эквивалентов ДНК, способных амплифицироваться в ПЦР, то теоретическое значение доли положительных результатов (N) можно определить по формуле:

N = (1 – e-n)·100%, (3)

где: е – основание натуральных логарифмов. Если n = 1, то N ≈ 63,2%.

Таким образом, для точного определения чувствительности метода необходимо воспользоваться корректирующим коэффициентом. В приведенном выше примере в формуле (3) вместо N необходимо подставить экспериментально полученное значение и затем решить уравнение относительно n, величина которого и будет являться корректирующим коэффициентом. При решении уравнения получаем n = – ln 0,24 ≈ 1,43.

Скорректированную величину чувствительности можно определить по формуле:

S/ = S : n. (4)

В приведенном выше примере

S/ = 5·102 : 1,43 ≈ 3,5·102 БОЕ·мл-1,

Найденные значения S/ и σs позволяют определить величину расчетной и минимальной ожидаемой концентрации возбудителя в исследуемой биопробе по следующим формулам:

Срасч = S/ : Р, (5)

Смин = S/ : σs : Р, (6)

где: S/– скорректированная чувствительность набора реагентов, выраженная в БОЕ·мл-1;
Срасч – расчетная концентрация возбудителя в исследуемой пробе с учетом разведения (при получении положительного результата при определении ОТ-ПЦР), выраженная в БОЕ·мл-1;
Смин – минимальная концентрация возбудителя в исследуемой пробе с учетом разведения (при получении положительного результата при определении ОТ-ПЦР), выраженная в БОЕ·мл-1;

Для приведенного выше примера S = 5·102 БОЕ·мл-1, n = 1,43, σs = 2,82, если Р = 10-1, то прогнозируемая концентрация составляет 3,5·103 БОЕ·мл-1, а минимальная концентрация возбудителя в исследуемой пробе составляет 1,3·103 БОЕ·мл-1.

В исследованиях, проведенных с кровью инфицированных морских свинок, мы попытались осуществить прогноз концентрации биологически активного вируса в исследуемой пробе по результатам постановки ОТ-ПЦР (пробы для постановки ПЦР готовили с использованием двукратного шага разведения). Одновременно с проведением ОТ-ПЦР определяли биологическую активность вируса в исследуемых пробах по методу негативных колоний.

Результаты определения вируса Хунин в пробах крови, полученных от инфицированных морских свинок с помощью ОТ-ПЦР и методом негативных колоний представленные в табл. 2, свидетельствуют о том, что ОТ-ПЦР может быть использована не только для выявления РНК вируса Хунин в исследуемой пробе, но и для прогноза фактической концентрации возбудителя в ней.

Выводы:

  1. Разработан метод определения чувствительности амплификационных наборов реагентов для ОТ-ПЦР и прогнозирования ожидаемой концентрации возбудителя в биопробах по результатам ПЦР.
  2. Величины скорректированной чувствительности метода (S/) и ошибки метода (σs) могут быть использованы для определения расчетной и минимальной ожидаемой концентрации возбудителя в биопробе.
  3. Разработанный метод определения чувствительности ПЦР, является универсальным для ПЦР наборов реагентов, предназначенных для выявления геномных НК возбудителей инфекционных заболеваний.

Литература:

  1. Бектимиров Т.А. Стандартизация и контроль медицинских биологических препаратов, изготовленных на основе современной биотехнологии. – М., 1987.
  2. Воробьев А.В., Быков А.С., Пашков Е.П. и др. Микробиология. – 2-е изд., испр. – М., 2003.
  3. Владыко А.С., Зайцева В.Н., Трофимов Н.М. Ложноположительные реакции при лабораторной диагностике вирусных геморрагических лихорадок Ласса, Марбург, Эбола и СПИДа // Вопр. вирусол. – 1997. – № 3. – С.232-234.
  4. Генес В.С. Некоторые простые методы кибернетической обработки данных диагностических и физиологических исследований. – М., 1967.
  5. Государственные испытания и регистрация новых медицинских иммунобиологических препаратов / Санитарные правила. СП. 3.3.2.561-96. Минздрав России. – М., 1998.
  6. Лакин Г.Ф. Биометрия. – М., 1990.
  7. ФС 42-3874-99. Физико-химические, физические и иммунохимические методы контроля медицинских иммунобиологических препаратов / МЗ РФ. – Введ. 03.02.00.
  8. Sambrook J., Russel D.W. Molecular Cloning, 3rd ed. // CSH Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 2001.
  9. VanGuilder H.D., Vrana K.E., Freeman W.M. Twenty-five years of quantitative PCR for gene expression analysis // Biotechniques. – 2008. – Vol. l44. – P. 619–626.
  10. Нетесов С.В., Маркович Н.А. Сравнительная оценка современных методов диагностики вирусных инфекций // Мол. мед. – 2008. – № 5. – С. 41-47.
 статья из журнала № 4 [40] Декабрь 2010
Главная / Обмен опытом / Методические подходы к определению чувствительности амплификационных наборов реагентов и прогнозированию ожидаемой концентрации возбудителя в биопробах по результатам ПЦР
  Научно-практический журнал "Биопрепараты"
Адрес редакции: ФГУН "ГИСК им. Л.А.Тарасевича" Минздравсоцразвития РФ, 119002, Москва, пер. Сивцев Вражек, 41.
Журнал зарегистрирован в Комитете РФ по печати ПИ №ФС77-26255 от 24.11.2006 г.

web@medep.ru


Совместный проект «Центр иммунопрофилактики МЕДЭП» и «Гелла-Принт»