Вакцина против геморрагической лихорадки с почечным синдромом

Автор: | 06.05.2019

В Институте полиомиелита и вирусных энцефалитов им. М.П.Чумакова РАМН разработана первая в России вакцина против геморрагической лихорадки с почечным синдромом (ГЛПС) «КомбиГЛПС-Вак», которая в своем составе содержит антигены двух серотипов хантавирусов Пуумала и Добрава. «Комби-ГЛПС-Вак» — это бивалентная, цельновирионная, инактивированная, концентрированная, сорбированная вакцина. Субстратом для накопления хантавирусов является перевиваемая линия клеток Vero (культура клеток почек африканской зеленой мартышки). В ФГУН «ГИСК им. Л.А. Тарасевича» проведена аттестация методов лабораторного исследования экспериментальных серий вакцины.

Возбудителем ГЛПС является вирус семейства Bunjaviridae (входит в состав рода Hantavirus). К настоящему времени известно около 30 генетически различных серотипов хантавирусов. На территории Российской Федерации установлена циркуляция четырех хантавирусных серотипов: Хантаан, Пуумала, Сеул, Добрава. Резервуаром вируса «Хантаан» на Дальнем Востоке является полевая мышь, в Европейской части Российской Федерации резервуаром вируса «Пуумала» является рыжая полевка. Человеку вирус передается чаще всего воздушно-капельным путем [1].

Наиболее эффективным и надежным методом профилактики ГЛПС является вакцинация населения, проживающего в районах, неблагополучных по геморрагической лихорадке. К настоящему времени вакцины против хантавирусов применяются для вакцинации населения в Южной Корее, Китае и Японии. Вакцины приготовлены на основе хантавируса серотипа Хантаан, распространенного на Дальнем Востоке. Эти препараты не обладают защитным действием против хантавируса серотипов Пуумала и Добрава, распространеных в Европейских регионах России. Цель данного исследования —изучение экспериментальных серий вакцины «Комби-ГЛПС-Вак» на соответствие требованиям, предъявляемым к сорбированным инактивированным вирусным вакцинам.

Материалы и методы

«Комби-ГЛПС-Вак» — вакцина против ГЛПС бивалентная, культуральная, инактивированная формалином, концентрированная, очищенная, сорбированная. Вакцина содержит антигены двух серотипов хантавирусов Пуумала и Добрава; титр вакцинного антигена в ИФА не менее 1:128, стабилизатор — альбумин человека донорский не более 0,1 мг/мл, сорбент — алюминия гидроксид 1,0+0,5 мг/мл.

1.0. Метод определения специфической безопасности вакцины

Для изучения специфической безопасности вакцины использовали: тест-культуру Vero E6 (перевиваемая линия клеток почек африканской зеленой мартышки), которая наиболее чувствительна к хантавирусам Пуумала и Добрава. Проводили по три последовательных пассажа материала, приготовленного из смеси 5 ампул исследуемой серии вакцины, с инкубацией 7-8 сут при температуре инкубации тест-культуры. Для последующего потенциального выявления инфекционных фокусов (ФОЕ) вируса ГЛПС использовали метод ИФА, с применением конъюгата — протеин А, меченый пероксидазой хрена.

Выявление темно-серых пятен (инфекционных фокусов вируса ГЛПС) свидетельствовует о наличии не инактивированного вируса ГЛПС в вакцине. Согласно требованиям проекта НД испытуемая вакцина не должна содержать живого вируса ГЛПС — ФОЕ должны отсутствовать при просмотре тест-культуры.

2.0. Метод определения специфической активности вакцины против ГЛПС

2.1. Для определения титра хантавирусов Пуумала и Добрава в вакцине использовали метод ИФА. Все компоненты реакции ИФА готовили самостоятельно. Иммуносорбент получали следующим образом. На полистироловом планшете предварительно сорбировали:ИГ+ (мышиные моноклональные антитела Н6, специфичные к эпитопу нуклеокапсидного белка вируса Пуумала);ИГ– (мышиные иммуноглобулины класса IgG, не содержащие антител к хантавирусам).К+ (положительный контроль) — контрольный антиген, представляющий собой очищенный концентрат антигенов хантавирусов Пуумала и Добрава, полученных на культуре клеток Vero E6.

Конъюгат — мышиные моноклональные антитела А4, специфичные к эпитопу нуклеокапсидного белка вируса Добрава, меченные пероксидазой хрена.

Результат учитывали при сравнении оптических плотностей в лунках, положительными считали те образцы, для которых показатель оптической плотности в лунке с ИГ+ превышал показатель оптической плотности в лунке с ИГ- в 2,1. Титр антигенов хантавирусов Пуумала и Добрава в вакцине должен быть не менее 1:128.

2.2. Метод определения специфической активности (иммуногенности) вакцины «Комби-ГЛПС-Вак» Для этой цели использовали: Опытная группа — мыши линии Balb/С в количестве 8 голов массой 18–20 г, которых иммунизировали внутримышечно по 0,5 мл вакцины 3-кратно с интервалами 2 недели.

Контрольная группа — мыши линии Balb/С в количестве 8 голов массой 18–20 г, которым вводили суспензию алюминия гидроксида.

Взятие крови через 2 недели после 3-й иммунизации, с последующим приготовлением сывороток. Содержание антител в иммунных мышиных сыворотках определяли в реакции нейтрализации (РН) в культуре клеток Vero E6 по снижению количества ФОЕ под воздействием специфических антител. Титр нейтрализующих антител к хантавирусам Пуумала и Добрава должен быть не менее 1:16.

3.0. Определение остаточной ДНК клеток Vero E6

Так как вакцина «Комби-ГЛПС-Вак» культуральная и субстратом для накопления хантавирусов Пуумала и Добрава служит перевиваемая линия клеток Vero E6, был разработан и аттестован метод определения остаточной ДНК клеток Vero E6. Определение проводили методом ПЦР в реальном времени. В качестве контроля использовали препарат геномной ДНК клеток Vero E6. Содержание ДНК культуры клеток Vero в вакцине должно быть не более 10 нг/мл, что соответствует требованиям ВОЗ.

Помимо указанных выше тестов, лабораторные серии были изучены по всем показателям оценки качества вирусных инактивированных сорбированных вакцин: описание, бактериальная стерильность, время седиментационной устойчивости, размер частиц, извлекаемый объем, пирогенность, аномальная токсичность, бактериальные эндотоксины.

Результаты и обсуждение

Согласно требованиям ВОЗ (серия № 848 технических докладов, 1994) при создании вакцины против ГЛПС должны быть определены требования на стадиях изготовления: к культуре клеток, используемой для накопления вируса; к антигенной активности вируса и методам инактивации; стерильности.

К готовой вакцине предъявляются требования по следующим показателям: стерильность, безопасность, идентичность, содержание белка, специфическая активность, стабильность, пирогенность, БСА, безопасность, содержание адъюванта; маркировка; упаковка.

Культура клеток Vero E6 (перевиваемая линия клеток почки африканской зеленой мартышки) — субстрат для накопления хантавирусов Пуумала и Добрава, была исследована по всем показателям, предъявляемым ВОЗ к клеточным культурам (стерильность, туморогенность, отсутствие посторонних вирусов и микоплазм), в том числе исследована на отсутствие цирковирусов свиней. На основании полученных результатов культура клеток Vero E6 была аттестована и разрешена для производства вакцины.

В ФГУН ИПВЭ им. М.П. Чумакова РАМН получена молекулярно-генетическая характеристика вакцинных штаммов вирусов Пуумала (ПУУ-ТКД/VERO) и Добрава (ДОБ-ЕАТ/VERO), адаптированных и прошедших пассирование в культуре клеток Vero E6 (10 и более пассажей), в сравнении с прототипными исходными штаммами Пуумала (ТКД/Уфа-97) и Добрава (ЕАТ/Липецк-06). В результате сравнительного анализа нуклеотидных последовательностей и аминокислот S, М и L сегментов РНК штаммов вируса было установлено практически полное сходство вакцинного и исходного штаммов (всего 0,1–0,3% отличий), полные сиквенсы зарегистрированы в GenBank. Вакцинные штаммы ПУУ-ТКД, ГКВ № 1026, 12.2000 г. VERO и ДОБ-ЕАТ/VERO, ГКВ № 1027, 12.2000 г. депонированы в Государственной коллекции вирусов НИИ вирусологии им. Д.И.Ивановского РАМН.

При исследовании трех экспериментально-лабораторных серий вакцины «Комби-ГЛПС-Вак» по показателю специфическая безопасность инфекционных фокусов вирусов ГЛПС выявлено не было. Серии вакцины не содержат неинактивированного вируса.

Титр антигенов хантавирусов Пуумала и Добрава в 3 сериях вакцины составил 1:512.

Специфическая активность по титру вируснейтрализующих антител исследованных серий вакцины «КомбиГЛПС-Вак» в реакции нейтрализации (РН) составила 1:16, т.е. соответствовал требованиям проекта НД. Содержание остаточной ДНК культуры клеток Vero E6 в сериях вакцины составило не более 0,195 нг/доза.

На основании исследования 3 экспериментальных серий вакцины «Комби-ГЛПС-Вак» показано соответствие разработанной новой вакцины требованиям проекта НД (ФСП). Результаты приведены в таблице.

Вывод:

Проведенные исследования являются основанием для организации производства и выпуска эксперимен тальнопроизводственных серий вакцины «Комби-ГЛПС-Вак» и решения вопроса о возможности клинических испытаний новой вакцины.