В статье изложены общие требования к характеристикам экспрессирующей конструкции и очищенного белка в соответствии с рекомендациями ВОЗ и ICH, которые должны быть включены в отчет о доклинических испытаниях новых иммунобиологических препаратов, изготовленных методами рекомбинантной ДНК. Изложенные требования касаются препаратов, активным веществом которых являются белки, пептиды, или производные белков и пептидов (цитокины, моноклональные антитела, рецепторы клеток, рекомбинантные факторы плазмы крови, вакцины на основе рекомбинантных белков – HBsAg, белков вируса папилломы и др.). Экспрессирующая конструкция должна быть охарактеризована с помощью методов исследования нуклеиновых кислот, приведена история ее создания, а также данные по ее стабильности. Получаемые целевые белки также должны быть охарактеризованы для подтверждения соответствия продукту рекомбинантной ДНК как в отношении первичной структуры (аминокислотная последовательность N- и C-концов белка, пептидное картирование), так и в отношении химических, иммунохимических и физико-химических параметров, включая вторичную и третичную структуру белка. Чистота белка должна быть не менее 95 %. Должно быть изучено содержание модифицированных, полимеризованных и деградированных форм рекомбинантного белка, а также содержание неспецифических примесей (веществ, использованных при получении и очистке целевого продукта). Содержание примеси белков и нуклеиновых кислот штамма-продуцента должно обеспечивать безопасность препарата и устанавливается для каждого конкретного препарата. Необходимость подробной характеристики экспрессирующей конструкции и очищенного белка обусловлена тем, что результаты доклинического изучения должны быть связаны с конкретным очищенным продуктом, а при оценке безопасности препарата используемые методы во многом обусловлены присутствием в нем конкретных примесей или контаминантов.
В клинической практике в настоящее время широко используются препараты цитокинов, интерферонов, моноклональных антител, рецепторов клеток, рекомбинантных факторов плазмы крови, а также вакцины на основе рекомбинантных белков – HBsAg, белков вируса папилломы и др. Активной субстанцией этих препаратов являются рекомбинантные белки, пептиды и их производные, которые получают с помощью систем экспрессии на основе бактерий, дрожжей, клеток млекопитающих и др.
Основная цель доклинических исследований – оценка безопасности, специфической активности, предполагаемой эффективности препарата для решения вопроса о проведении клинических испытаний и последующей регистрации препарата [1 – 3, 11].
Информативность указанных исследований определяется степенью изученности физико-химических и иммунохимических свойств активной субстанции и готового препарата, а также охарактеризованными клетками-продуцентами.
В соответствии с отечественными и международными рекомендациями в досье, представляемое для регистрации препарата, в раздел доклинического изучения должны быть включены сведения, касающиеся характеристики экспрессирующей конструкции и очищенного рекомбинантного белка (активной субстанции) [1, 5, 7, 9, 10]. В доклинических исследованиях должны испытываться препараты с установленными спецификациями на активную субстанцию и готовый препарат, показатели, выбранные для контроля, должны обеспечивать необходимое качество продукта [1, 5, 10]. Для получения рекомбинантного белка должна использоваться система банков клеток, которые должны быть аттестованы в установленном порядке [4, 6, 8].
Характеристика экспрессирующей конструкции. Цель оценки экспрессирующей конструкции – подтверждение того, что в клетку-хозяина введена нуклеотидная последовательность, соответствующая требуемому белку, и что она сохраняется в клеточной культуре до конца продуктивного периода.
Экспрессирующая конструкция, содержащая кодирующую последовательность рекомбинантного белка, должна быть охарактеризована с помощью методов исследования нуклеиновых кислот.
Оценку экспрессирующей конструкции на уровне нуклеиновой кислоты необходимо рассматривать как часть оценки качества. Следует учитывать, что эта проверка относится только к кодирующей последовательности рекомбинантного гена и не отвечает ни за точность его трансляции, ни за другие характеристики рекомбинантного белка, такие как вторичная и третичная структура или посттрансляционные модификации.
Необходимость оценки экспрессирующей конструкции диктуется возможностью возникновения мутаций в последовательности генов рекомбинантного белка, продуцируемого в живых клетках, что может изменять его свойства и привести к негативным последствиям при использовании готового лекарственного препарата, полученного на основе данного белка. Аналитическая методика для установления нуклеотидной последовательности гена должна быть охарактеризована в отношении предела обнаружения измененной последовательности. Такой анализ необходим, поскольку методы анализа белков не всегда позволяют обнаружить все изменения в структуре белка, возникающие в результате мутаций.
Анализ нуклеотидной последовательности может быть использован для проверки кодирующей последовательности и физического состояния экспрессирующей конструкции. Этот анализ проводится для подтверждения того, что экспрессируемый белок будет иметь правильную аминокислотную последовательность, но не направлен на обнаружение низких уровней измененных последовательностей. Если продуцирующие клетки несут множественные встроенные копии экспрессирующей конструкции, не все из которых могут быть транскрипционно активны, проверка собственно продукта транскрипции путём анализа мРНК или кДНК иногда оказывается более информативной, чем анализ геномной ДНК. Исследование суммарных нуклеиновых кислот, например, материала, амплифицированного в полимеразной цепной реакции, можно рассматривать как альтернативу подходам, основанным на отборе индивидуальных клонов ДНК. При исследовании могут быть использованы и другие научно обоснованные методы, позволяющие быстро и с высокой точностью подтвердить кодирующую последовательность рекомбинантного белка в экспрессирующей конструкции.
В отношении конструкции гена, кодирующего рекомбинантный белок, должны быть представлены следующие сведения:
- информация о линии клеток и векторах, используемых в продуцировании рекомбинантного белка,
- описание источника нуклеотидной последовательности, кодирующей целевой белок, методов получения ДНК, кодирующей целевой белок,
- описание стадий сборки экспрессирующей конструкции, включающее происхождение и функцию составных частей экспрессирующей конструкции, как, например, точки начала репликации, гены устойчивости к антибиотикам, промоторы, энхансеры, является ли белок белком слияния,
- методы, используемые для введения вектора в клетку-хозяина, отбор и клонирование трансформантов, критерии отбора,
- состояние вектора внутри клетки-хозяина,
- нуклеотидные последовательности целевых генов и фланкирующих регуляторных областей векторов экспрессии. Должны быть указаны области, секвенированные в процессе конструирования, и области, последовательности которых указаны на основании данных литературы. Последовательности мест соединения составных частей экспрессирующей конструкции при использовании лигирования должны быть подтверждены секвенированием,
- материалы исследования с использованием различных рестриктаз и методов саузерн-блот или норзерн-блот, подтверждающие включение вектора в клетку хозяина,
- описание метода индуцирования экспрессии соответствующего гена и контроля ее в процессе производства,
- идентификация всех известных экспрессирующих последовательностей,
- указание любых дополнительных модификаций.
Клетки-продуценты должны быть охарактеризованы по генетической стабильности. Предел возраста для клеток-продуцентов in vitro устанавливают на основе изучения клеток, культивируемых в условиях пилотного производства до предполагаемого возраста и старше, и подтверждают в дальнейшем в условиях полномасштабного производства. Экспрессирующая конструкция клеток-продуцентов исследуется в соответствии с положениями, изложенными выше, при этом кодирующая последовательность может быть подтверждена либо исследованием нуклеиновой кислоты, либо анализом целевого белкового продукта.
При оценке стабильности генетические и фенотипические характеристики системы хозяин/вектор должны исследоваться на материале, полученном до и после установленного возраста клеток-продуцентов in vitro (далее подтверждено при полномасштабном производстве). Исследования стабильности заключаются в получении информации о копийности гена, уровне и постоянстве экспрессии белка, характеристике рекомбинантного белка на уровне белка и/или последовательности ДНК (при использовании любого метода должен быть указан предел обнаружения отклонений от установленных параметров на основе проведенной валидации методики).
Любое увеличение ранее установленного предела возраста клеток-продуцентов in vitro должно быть обосновано данными, полученными на клетках, которые культивировались до возраста клеток in vitro, равного или превышающего новый предел возраста клеток in vitro.
Характеристика очищенных белков. Получаемые целевые белки должны быть охарактеризованы для подтверждения соответствия продукту рекомбинантной ДНК.
Единого экспериментального подхода, который мог бы обнаружить все возможные изменения в белке, не существует. Методы анализа белка могут включать определение аминокислотной последовательности, структурных особенностей, возникающих в результате посттрансляционных модификаций, таких как протеолиз, гликозилирование, фосфорилирование, ацетилирование.
Препарат, используемый для проведения доклинических испытаний, должен быть достаточно полно охарактеризован по химическим, иммунохимическим и физико-химическим параметрам, включая вторичную и третичную структуру белка. Это обусловлено тем, что, во-первых, результаты доклинического изучения должны быть связаны с конкретным очищенным продуктом, во-вторых, при оценке безопасности препарата используемые методы во многом обусловлены присутствием в нем конкретных примесей или контаминантов. При проведении данных исследований характеризуют очищенный белок – субстанцию препарата, в которой оценивают молекулярную массу, первичную (в том числе N- и С – концевые последовательности, замены аминокислот)), вторичную и третичную структуры белка, содержание белка, чистоту активного вещества, содержание модифицированных, полимеризованных и деградированных форм рекомбинантного белка, а также содержание неспецифических примесей (веществ, использованных при получении и очистке целевого продукта). При необходимости оценивают содержание углеводов и липидов, степень гликозилирования.
Исследования для характеристики очищенного белка должны включать широкий спектр аналитических методов, например, электрофорез в полиакриламидном геле с SDS в редуцирующих и нередуцирующих условиях, капиллярный электрофорез, изоэлектрическое фокусирование, высокоэффективную жидкостную хроматографию, пептидное картирование, в том числе в сочетании с масс-спектрометрией, анализ аминокислотной последовательности, круговой дихроизм, углеводное картирование и др.
При производстве необходимо использовать максимально эффективные способы очистки препарата от примесей и контаминантов, поскольку они во многом предопределяют необходимость проведения исследований по оценке безопасности препарата при доклинических испытаниях.
В отношении неспецифических примесей препарат должен быть охарактеризован по следующим параметрам:
- наличие примеси белков клетки-хозяина (бактерии, дрожжи, клетки млекопитающих и др.) или других гетерологичных белков (например, компонентов питательной среды, носителя для очистки с помощью аффинной хроматографии и т.д.), которые обусловливают потенциальный риск развития аллергических реакций и проявления других иммунопатологических эффектов;
- наличие примеси нуклеиновых кислот штамма-продуцента, которая теоретически не исключает возможность интеграции их в геном клеток организма хозяина;
- отсутствие контаминации вирусами продуктов, полученных из клеток-продуцентов, содержащих эндогенный вирус.
Поскольку линии клеток, продуцирующие гуманизированные моноклональные антитела, как правило, являются опухолевыми, следует считать перспективным дальнейшее совершенствование требований к ним с точки зрения характеристики продуцируемых белков в отношении онкогенности. Результаты этих исследований позволят целенаправленно оценивать данные белки в препаратах соответствующих антител.
Чистота белка должна быть не менее 95 %. В настоящее время многие производители обеспечивают чистоту не менее 97 %. Допустимое содержание примеси белков и нуклеиновых кислот клеток-продуцентов устанавливается для каждого конкретного препарата и должно обеспечивать его безопасность.
Перечень изучаемых физико-химических показателей для характеристики продукта, как правило, превышает таковые при включении в нормативную документацию на субстанцию.
Таким образом, характеристика экспрессирующей конструкции и очищенного экспрессируемого белка – обязательные элементы доклинических исследований, необходимые для объективной оценки результатов доклинических испытаний безопасности и эффективности иммунобиологических лекарственных препаратов, полученных с использованием методов генной инженерии. Полнота характеристик нуклеиновой кислоты и белка может отличаться у различных продуктов, что зависит от доступности используемых методов исследования.